Classification des souches de E.Coli

voir ici

Carte des vecteurs procaryote pGEX

Lien vers le site de GE

Extraction d'ADN de S.cerevisiae (levure)

Utilisation du kit "wizard genomics DNA purification kit" de promega

Le moins evident de pouvoir apprecier l'effet de la lyticase

1- Préculture O/N de S228g dans 5ml de milieu YPD à 30°C et 200rpm
2- Culture de 10ml en milieu YPD pendant 20h à 30°C
3- Centrifuger 2min à 13000g à8°C
5- Addition de 100µl de lyticase 20mg/ml (moi dans mon cas j'ai commander cette lyticase chez sigma refL2524-25KU)
6- Incubation à 37°C pendant 2h
7-Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
8- Resuspendre dans 3ml de Nuclei Lysis Solution
9- Ajouter 1ml de proteine precipitation solution, vortexer et incuber 5min dans la glace
10- Centrifugation à 13000g pendant 3min à8°C
11- Transferer le surnageant dans un tube propre et ajouter 3ml d'isopropanol (mis à RT avant) et mélanger par retournemant de tube.
12- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
13- Vider le surnageant et laver avec 3ml d'éthanol 70% (mis à RT avant)
14- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
15- Vider le maximun d'éthanol par pipettage et laisser évaporer le reste
16- Rehydrater dans 500µl de DNA rehydration solution
17- Ajouter 15µl de Rnase et incuber 15min à 37°C
18- Laisser finir la rehydratation en placant le tube O/N à 4°C ( ou 1h à 65°C)

Modifications :
- à 20 on suit le protocole en adaptant les volumes ( données pour 1ml de culture dans le protocole Promega), au final on remet l'ADN en solution en tampon TE10.1)

A la fin de 10ml de culture on récupère 500µl de solution d'ADN à environ 100ng/µl, ce qui permet de faire environ 500PCR.

Formules utiles en biologie

Méthodes de production de proteines recombinantes

La production et la purification de protéine pour les NULS

et cliquer clique ici

Manuel d'utilisation de la Taq DNA polymérase

Manuel d'utilisation de la Taq DNA polymérase ici, ou aller voir sur le site de invitrogen

Manuel d'utilisation de la Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity

Manuel d'utilisation de la Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity ici ou aller voir sur le site de invitrogen

Elongation à 68°C, 1 min / KB

Manuel d'utilisation de la Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (F-530)

Manuel d'utilisation de la Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase (F-530) ici ou aller voir sur le site de ici

Procedure pour l'addition de 3' A-overhangs (TA cloning)

Phusion™ DNA Polymerases create blunt end DNA products. When cloning fragments amplified with Phusion DNA Polymerases, blunt end cloning is recommended.

If TA cloning is required, it can be performed by adding 3' A overhangs to the blunt PCR product with a different polymerase (e.g. DyNAzyme™ II DNA Polymerase, Finnzymes).

Procedure for adding 3' A-overhangs (TA cloning)

1. Purify the PCR product (e.g. with a commercial PCR purification kit or phenol extraction and DNA precipitation)
Before adding the overhangs it is very important to remove all the Phusion DNA Polymerase by purifying the PCR product carefully, as the proofreading activity in Phusion DNA Polymerase is very strong. Any remaining Phusion DNA Polymerase will degrade the A overhangs, thus creating blunt ends again.

2. A-addition with DyNAzyme II DNA Polymerase (or Taq DNA polymerase)

Reaction components:

• Purified PCR product
• 0.2 mM dATP
• 1x Optimized DyNAzyme™ Buffer
• 1 U DyNAzyme II DNA Polymerase

Incubate 20 min at 72 °C.

3. Proceed to TA cloning. For optimal ligation efficiency, we recommend using fresh PCR products, since 3´A-overhangs will gradually be lost during storage.

Plasmide à basse ou haute copies ?

Cela dépend de son origine de réplication. Vous trouverez quelques exemples des origines et de la copie-numéro associée.

Préparation de bleu de laemmli 6X SDS-PAGE Sample buffer

Recipe to prepare 10 ml:

- 1.2gr SDS (sodium dodecyl sulfate)
- 6mg bromophenol blue
- 4.7ml glycerol
- 1.2ml Tris 0.5M pH6.8
- 2.1ml distilled water warm it a little bit and shake it till everything is dissolved. It takes time.
- add 0.93gr DTT or bMe

Wait until it is completely dissolved.

Aliquote and keep frozen at-20ºC.

PCR touchdown manuelle

Programme PCR n°50
Stage 1
95°C X 2min X 1 cycle

Stage 2
92°C X 20"
64°C X 30" X 4 cycles
70°C X 30-60" (ou 1kb/min)

Stage 3
92°C X 20"
61°C X 30" X 4 cycles
70°C X (ou 1kb/min)

Stage 4
92°C X 20"
58°C X 30" X 4 cycles
70°C X (ou 1kb/min)

Stage 5
92°C X 20"
55°C X 30" X 25-35 cycles
70°C X (ou 1kb/min)

Stage 6
70°C X 5min X 1 cycle

Commande d'oligos chez MWG

Aller sur ce site http://www.eurofinsdna.com/
- cliquer sur Shop puis eShop login
- se logger dans login for users, avec mes identifiants bruno.faivre@u-psud.fr, america
- cliquer sur oligonucleotide puis multiple & upload
- remplir le champs avec sa liste de primers sous cette forme
Snu17-112-NcoI GTCCCATGGGCAAAAGGAGTTTACAAAAATACTATGAAGCT
- Dans Scale mettre 0.05µmol
- Dans Purification mettre HPSF
- Puis cliquer sur Save
- Vérifier, puis cliquer sur To Order Basket
- Cliquer sur Order Now
- Pour Shipping Adresse et VAT ID mettre comme ci dessous

- Et mettre Pay by : Purchase Order (receive an invoice)
- Cliquer sur Confirm Order

Concentration ADN

L’ADN pour l’électroporation doit avoir une faible concentration en sel. L’ADN doit etre purifié par précipitation.
Purification d’ADN par précipitation :

1. Ajouter 5 à 10 µg de tRNA au 20µl de la reaction de ligation dans un tube de 1.5ml. Ajouter 22µl de 5M acétate ammonium ( ou un volume équal au volume de la réaction de ligation avec les tRNA. Bien mélanger.

2. Ajouter 100µl d’éthanol absolue ( ou 2.5 volumes de la reaction de ligation avec les tRNA . Glace 15 min.

3. Centrifuger >12,000 x g pour 15 min à 4°C. Eliminer le surnageant.

4. Laver le culot avec 1 ml de 70% ethanol. Centrifuger >12,000 x g pendant 15 min à RT. Eliminer le surnageant.

5. Sécher le culot.

6. Resuspendre avec du tampon EB. Pour les réactions de ligation, il faut reprendre dans 10µl


DEUXIÈME MÉTHODE de qiagen :

Ethanol Precipitation of DNA
Reagents Needed:

• 3 M sodium acetate pH 5.2 or 5 M ammonium acetate
• DNA
• 100% ethanol

Protocol

1. Measure the volume of the DNA sample.
2. Add 1/10 volume of sodium acetate, pH 5.2, (final concentration of 0.3 M)
- These amounts assume that the DNA is in TE only; if DNA is in a
solution containing salt, adjust salt accordingly to achieve
the correct final concentration.
3. Mix well.
4. Add 2 to 2.5 volumes of cold 100% ethanol (calculated after salt addition).
5. Mix well.
6. Place on ice or at -20 degrees C for >20 minutes.
7. Spin a maximum speed in a microfuge 10-15 min.
8. Carefully decant supernatant.
9. Add 1 ml 70% ethanol. Mix. Spin briefly. Carefully decant supernatant.
10. Air dry or briefly vacuum dry pellet.
11. Resuspend pellet in the appropriate volume of TE or water.

autre protocol voir ici

TROISIEME METHODE avec glycogen

Procedure   
- Add 0.1 volumes of 3M Sodium Acetate solution to 1 volume of DNA sample.  
- Add 1ul Glycogen to the DNA sample.  
- Add 2 volumes of 95% EtOH to the DNA Sample.  
- Store the solution overnight at -20°C or for 30 minutes at -80°C.  
- Centrifuge the solution at maximum speed for least 15 minutes.  
- Decant and discard the supernatant.  
- (Optional) Add 1 ml of 70% EtOH to the pellet and let sit for 5 minutes.  
- (Optional) Centrifuge the sample at maximum spped for 5 minutes.  
- (Optional) Decant and Discard the supernatant.  
- Air-dry the pellet for 10-15 minutes at room temperature until all liquid is gone.  
-Resuspend in desired volume of water or buffer

Article sur l'effet de la durée d'incubation, la température et le temps de centrifugation lors de la précipitation d'ADN

Protocole de clonage : Préparation du vecteur

Préparation d'un vecteur en vue du clonage :
- Transformation du vecteur dans des bactéries Xl1Blue
- Préparer 4 pré cultures de 10ml en milieu 2YT sélectif
- Miniprep sur les pré cultures (midiprep de préférence et éluer dans 100µl d'H2O)
- Eluer dans 4 X 50µl d'eau stérile pH 7.5
- Mesurer la concentration
- Digestion du vecteur, il faut essayer d'avoir 5µg de vecteur, rajouter les enzymes 1µl, le tampon 10X, la BSA 100X, avec un qsp à 50µl ou 100µl dépend du volume de vecteur a rajouter.
- Digestion O/N à 37°C de 18h à 9h

Réaction de déphosphorylation
- ne pas ajouter 10µl de Tp 10X SAP au 100µl ou 50µl de vecteur purifié
- 2µl de phosphatase de crevette
- 2h à 37°C
- inactivation de l'enzyme SAP 15min à 65°C

- Déposer la totalité du produit de digestion déphosphorylé sur gel d'agarose 1%, 100µl + 10µl de loading buffer
- Découpage des bandes correspondant au vecteur, pour éliminer l'insert, attention à bien nettoyer la lame avec de l'éthanol 70%, si on veut purifier plusieurs vecteurs différents, afin d'éviter les contaminations croisées
- Utillisation du kit Qiagen Gel Extraction
- Elution dans 30µl d'eau stérile

Transformation de bactéries électro-compétentes

Electroporation de bactéries électro compétentes

- Prendre un tube de bactéries électro compétentes à -80°C (Top10F’)

- Utiliser 100 µl de bactéries compétentes + 1 µl d’ADN , ne pas trop charger en solution d’ADN car c’est chargé en sel, et au moment de la décharge ça peut déclencher un arc électrique, et l’électroporation ne fonctionne pas dans ces conditions.

- Préparer des cuves d’électroporation avec le bouchon jaune, y placer les bactéries + l’ADN à électroporer. (Garder ces cuves d’électroporation dans la glace)

- Utiliser l’électroporateur avec les paramètres suivants Ecl2 (pour les bactéries). Pour les appareils anciens prendre comme paramètre 2.5 kV et durée de la décharge 50 ms.

- Une fois la décharge effectuée, mettre 900 µl du milieu LB immédiatement dans la cuve qui vient d’être électroporer.

- Puis 1h à 37°C avec d’étaler sur boite ou dans les milieux sélectifs.

Purification avec tag inteine

Purification inteine de Fne (33 kDa)

Production en milieu auto inductible :

- 1^er préculture : 10 ml de milieu 2YT 1 journée à 37°C à 200rpm, partir de la souche qui est à -80°C

- 2eme préculture : 100 ml de milieu M-NAI-ZY ( milieu autoinductible ) overnight à 37°C à 200rpm

- Production : 1L de milieu M-AI-ZY ( milieu auto inductible ) 200 rpm à partir des 100 ml d’inoculum, pendant 8h à 37°C ou 24h à 25 °C ou 48h à 15°C selon la solubilité de la proteine.

Solution nécessaire :

- tampon de lavage : 20mM Tris-HCl pH 8 (4ml de tris hcl ph7.5 1M), 500mM NaCl (20ml de nacl 5M), 0.1 mM EDTA (40µl EDTA 0.5M), 0.1%triton (2ml de triton 10%). Volume final 200ml à compléter avec 174 ml eau

- tampon de clivage : 20mM Tris-HCl ph 8 (1ml de tris 1M), 50mM NaCl (5ml de nacl 5M), 0.1 mM EDTA (10µl EDTA 0.5M) 30 mM dithiothréitol DTT (1.5ml de DTT 1M). Preparation du DTT 1M 0.77g pour 5ml de DTT

Gel SDS page, pour chaque échantillon faire

- Extrait brute après sonication.

- Fraction soluble après centrifugation 4°C, 4000g

- Flowthrought

- Fraction d’élution après passage de tampon de clivage.

Clivage à 4°C : la proteine avec le tag intéine, clivage grâce à la réduction du DTT. L’inteine se fixe sur les billes de chitine, car elle possède un domaine de fixation à la chitine.

Protocole :

- Ajouter du trition 0.1% 100X après la sonication. (400µl de triton 10% X100)

- Sonication à froid. (4cycle avec tous les paramètres a 4, output 4, cycle duty 4)

- Reprendre les extraits brutes induit / et non induit dans 20 µl

- Centrifuger après la centrifugation 12000g, 30 min et filtrer à 0.45µm

- Garder le culot à -20°C

- Garder 40µl de surnageant + bleu de laemmli 4X

Equilibration de la colonne :

- ajouter 6 ml de bille de chitine

- équilibrer avec 60 ml de tp de lavage

- ajouter le surnageant après la centrifugation et la filtration

- Prendre 40µl de flowthrought + bleu de laemmili 4X

Lavage de la colonne :

- laver avec 100 ml de tp de lavage

- prendre 40µl de flowthrought + bleu de laemmli 4X

Clivage :

- laver avec 18 ml de tp de clivage ou 3 volume de colonne

- prendre 40 µl de Flowthrought + 20 µl de bleu de laemmili

- Stopper le flux et laisser à 4°C O/N

Elution :

- laver avec du tp de lavage, 3 volumes de colonne

- prendre 40 µl + 20 µl de bleu de laemmili

- Faire les gels SDS-page.

Régénération de la colonne :

- laver la colonne avec 3 volumes de 1% SDS, suivi de 5 volumes de H2O, puis 5 volumes de tp de lavage.

Production de bactéries chimio-compétentes

Travailler à froid durant toute la manip

- Pré culture de 5 ml de 2yt sans antibio (ou avec), à partir du master stock, 200 rpm à 37°C
- Inoculer avec 1% de préculture, une culture de 200 ml de 2yt en milieu stérile
- A DO600 environ 0,5 à 0,7, placer la culture dans la glace 10min
- Répartir en 4X50 ml dans des tubes corning
- placer la culture dans la glace 10min
- Centrifuger 15min à 3000 rpm à 4°C
- Éliminer le surnageant
- Mettre les culots dans la glace
- Resuspendre très doucement (à l'aide d'une pipette de 50ml) avec du CaCl2 50-100mM, 25ml dans chaque tube.
- Centrifugation 15min à 3000rpm
- Resuspendre très doucement (à l'aide d'une pipette de 50ml) avec du CaCl2 50-100mM, 25ml dans chaque tube.
- Laisser 30 minutes dans la glace
- Rassembler dans 2 tube de 50ml
- Centrifugation 15min à 3000rpm
- Resuspendre doucement avec 1.6 ml de CaCl2 50-100mM et glycérol 10% (400µl de glycérol 50%) pour chacun des 2 tubes, puis pooler les 2 tubes, on a 4 ml de bactéries.
- Aliquoter par 100µl
- Flash freezer dans l'azote liquide si possible, sinon congélation à -80°C directe

Conservation 3 mois max

Dosage des acides nucléiques

Les bases puriques et purimidiques absorbant fortement à 260nm, on a une unité de densité optique à 260nm correspond :
- pour une solution d'ADN double brin à 50µg/ml
- pour une solution d'ARN ou d'ADN simple brin à 25µg/ml

Ces valeurs s'appliquent à des acides nucléiques parfaitement purs et en solution homogène.

Aussi il convient de rechercher une éventuelle contamination protéique car les protéines absorbent non seulement à 280nm mais aussi à 260nm. Pour cette raison on effectue une seconde mesure de DO à 280nm. Un ADN pur doit avoir un rapport DO 260 / DO 280 compris entre 1,8 et 2.Une éventuelle contamination par du phénol peut être recherchée en mesurant l'absorption à 270nm.

Exemple :
Conc ADN = DO260 X 50µg/ml X facteur de dilution

Conc ADN = 0,256 X 50µg/ml X 20 (généralement je fais 5µl d'ADN dans 95µl d'eau, dilution au 20eme)= 152µg/ml ou 152ng/µl

Quantité totale = 152 X 50µl = 7600ng ou 7,6µg

Polymerase chain reaction (PCR)

Vidéo explicative

Préparation de EDTA 0,5M

Pour 1L :

186.1 g. EDTA
700 mL H2O
Ajuster à pH 8.0 avec 10M NaOH (ça aide à dissoudre l'EDTA)
q.s.p 1 L H2O

 

NOTES:

EDTA will not go into solution until pH approaches 8.0.

Préparation de Tris pH 7,5

Pour 500 ml :

60.5 g. Tris Base
400 mL H2O
pH to 7.4 (ou 8.0) avec du HCl
q.s.p avec 500 mL de H2O

Préparation de 5M NaCl

Pour 500 ml :

146 g NaCl
q.s.p jusqu'à 500 mL avec H₂O

Préparation du décolorant de gel SDS PAGE

Pour 5L :

500 mL Methanol
500 mL Glacial Acetic acid
4 L H₂O

Préparation du colorant de gel SDS PAGE

Pour 1L :

2.5 g. Coomassie brilliant blue
500 mL Methanol
425 mL H₂O
75 mL glacial acetic acid

OU

Rapid Coomassie Staining Solution 

 50 ml glacial acetic acid 
0.03 g Coomassie BB R-250 
450 ml distilled water
* Store at room temperature indefinitely

Transformation de bactéries chimio-compétentes

Principe : Introduire un plasmide dans une bactérie, afin de multiplier ce plasmide et l'utiliser pour d'autres applications, ou de produire une protéine avec l'utilisation de bactérie compétente du type BL21DE3gold.

1. Refroidir les bactéries compétentes sur la glace

2. Transférer 100µl/transformations de bactéries compétentes dans les tubes sur la glace

3. Ajouter 1-2 µl de produit de ligation ou de plasmide

4. Laisser sur la glace 30 min

5. Faire le choc thermique à 42 °C pendant 45 sec, puis le mettre immédiatement dans la glace

6. Ajouter 800-900 µl de milieu LB ou 2YT et incuber à 37 °C pendant 45 min

Etaler 100-200 µl sur milieu 2YT ou LB agar et ­ incuber à 37 °C overnight

Gamme de pH d'utilisation de tampon biologique

Voir ici

Différence entre Tris-Base et Tris-HCl

En faite, c'est la même chose. La gamme utilisation de ce tampon est entre pH 7 et 9.
Pour préparer un tampon Tris, on peut prendre du Tris-Base et ajuster le pH avec de HCl et ajuster au volume final, ou prendre du Tris-HCl et ajuster avec de NaOH ou du KOH (ça dépend du sel que l'on veut dans le tampon).

La meilleur façon de préparer ce tampon, et de préparer un mélange de Tris-Base et de Tris-HCl, mixer les 2, pour obtenir le pH désirer. (voir ici)

Carte du vecteur procaryote pET9 a-d

Lien vers le site de Novagen

Carte du vecteur procaryote pET21 a-d

Lien vers le site de Novagen

Carte du vecteur procaryote pET28 a-c

Lien vers le site de Novagen

DNA Insert Ligation into Vector DNA

1) The ligation mixture contains the following:

1. vector DNA (~100 ng)
2. insert DNA (equimolar or 2 or 3 X molar concentration of vector)
3. water added to 18 µl

2) Heat the mixture at 45 °C for 5 min. to melt any annealed cohesive ends.

3) Cool on ice. Add

1. ligase buffer (+ATP) 2 µl
2. ligase 0.5 µl

4) Incubate reaction mixture at 14 °C for 2 - 4 hours or overnight at 4 °C.

5) Heat ligation mixture at 65 °C for 10 minutes to deactivate the ligase.

6) Use 5 - 10 µl of the ligation mixture to transform competent cells.

Note:

a) In order for the DNA to circularise, it is important not to use too high a concentration of DNA (high concentration of DNA promotes intermolecular reaction and therefore forms long linear molecules). Concentration of vector DNA should normally be <10 href="http://www-lmmb.ncifcrf.gov/%7Etoms/delila/lig.html">Calculation to obtain the best vector and insert concentration is normally not required.
b) Do a control ligation of the vector without any insert. If the background is low, there is no need for screening of the transformed cells for vector with ligated insert.
c) For blunt end ligation (which is much less efficient compare to cohesive end ligation), use a higher concentration of DNA and ligase (~10 X). Higher concentration of ligase (~5x) is also useful for sticky end ligation if ligation time is short.
d) Only use phosphatase when strictly necessary. Fewer steps means less problem. If it is necessary to use it, choose SAP (shrimp alkaline phosphatase - easier to deactivate) instead of CIP. Only use the recommended amount as too much can damage the ends of DNA (this is very important - damaged ends won't ligate).
e) Avoid using TBE when gel-purifying DNA (use TAE instead). Also use the best grade agarose or low m.p. agarose for the gel. Contaminants (such as sulphated agarose) can affect your ligation efficiency. DNA should always be gel-purified before ligation.
f) Some enzymes have been suggested to be able to stick to the ends of DNA thereby affecting ligation. There is uncertainty if this is the case, or if it is a problem of enzyme carrying over during purification. In such cases the DNA solution needs to be treated with proteinase K followed by phenol/chloroform . Taq polymerase, for example, may not be completely removed during purification and can fill in the digested end of DNA and thereby preventing ligation. Restriction enzymes can also digest ligated DNA. Gel purification, however, should remove the restriction enzymes well
g) Keep the buffer in small aliquots as the freezing/defrosting cycles may damage the ATP. Also do not use too high a concentration of ATP (max. 0.5mM) for blunt-end ligation as polyadenation of blunt-ended DNA may occur?
h) The ligase works best at higher temperature but the reaction temperature is kept low to allow the ends of the DNA to anneal together. The Tm of the ends are generally ~ 12-16 °C, but EcoRI may be lower (5-6 °C) since ends are AATT. (For blunt-end ligation, the temperature may not be so important, ligation at higher temperature may therefore be more desirable.)
i) Avoid use condensing agents like hexaminecobalt chloride especially for sticky end ligation. They promote intermolecular reaction therefore form concatamers rather than closed plasmids. However, if you must use them, make sure there's K+ in the buffer which promote circularisation of plasmid.
j) One useful idea in blunt-end ligation, add restriction enzymes in the ligation mixture - normally blunt-end ligation of insert to vector does not reform the restriction site (therefore when you design the oligo that make sure it doesn't reform the restriction site when ligated), therefore only religated vector is digested. See one-tube PCR cloning for an example.
k) Do remember to polish off the ends after PCR if you're doing blunt-end ligation of PCR product produced by Taq polymerase. However, there's no adenylation for other polymerases like Tli.
l)Use only highly competent cells for transformation in cloning work. Expect 50-1000 transformants (if things go well that is).
m) It is possible to clone gene without doing ligation. Basically, you add extra 11-12 bases LIC site (ligation independent cloning site). The PCR products are digested in the presence of T4DNA polymerase with dTTP or dATP which expose the LIC site when can annealed with another LIC site on the vector (available from Pharmingen and Novagen) which can then be transformed. See
Haun et al, Biotechniques 13(4)515-8, 1992,
Rashtchian, Current Opinion in Biotechnology 6:30-36, 1995
n) Make-your-own TA-cloning vector - can use plasmid pDK101 [ATCC 77406], a derivative of plasmid pGEM[R]5fZ(+). Digest with the endonuclease XcmI which give the overhangs for cloning. Another way is to digest pBluescript with EcoRV and perform a Taq polymerase 3'-terminal addition in the presence of dTTP. See TIBS article "Cloning PCR products using TA vectors" for more discussion on TA-cloning and also other protocols sites to making T vector.

Production de bactéries électro-compétentes

ATTENTION TRAVAILLER à FROID

- Pré-culture de 5ml 2yt sans antibio, 200 rpm à 37°C
- Culture de 500ml en milieu stérile 2YT
- Les cultiver jusqu'a DO 0.5-0.7
- Mettre l'erlen dans l'eau glacé
- Répartir en 10 X 50ml
- Centrifuger 6min à 5000g à 4°C
- Eliminer le surnageant
- Mettre les culots dans la glace
- Resuspendre doucement avec 25ml d'eau glacée
- Pooler les tubes afin d'avoir 5 tubes corning avec 50ml
- Centrifuger 6min à 5000g à 4°C
- Eliminer le surnageant
- Resuspendre avec 12.5ml d'eau glacée
- Pooler les tubes afin d'avoir 2 tubes corning
- Centrifuger 6min à 5000g à 4°C
- Eliminer le surnageant
- Resuspendre avec 6.25ml d'eau glacée
- Pooler les tubes afin d'avoir 1 tube corning
- Centrifuger 6min à 5000g à 4°C
- Eliminer le surnageant
- Resuspendre le tube avec 3.2ml d'eau glacée, et rajouter 800µl de glycérol 50%
- Faire des aliquots de 100µl
- Flash freezer avec de l'azote liquide, si possible sinon congélation à -80°C directe
- Congeler à -80°C