Purification avec tag inteine

Purification inteine de Fne (33 kDa)

Production en milieu auto inductible :

- 1^er préculture : 10 ml de milieu 2YT 1 journée à 37°C à 200rpm, partir de la souche qui est à -80°C

- 2eme préculture : 100 ml de milieu M-NAI-ZY ( milieu autoinductible ) overnight à 37°C à 200rpm

- Production : 1L de milieu M-AI-ZY ( milieu auto inductible ) 200 rpm à partir des 100 ml d’inoculum, pendant 8h à 37°C ou 24h à 25 °C ou 48h à 15°C selon la solubilité de la proteine.

Solution nécessaire :

- tampon de lavage : 20mM Tris-HCl pH 8 (4ml de tris hcl ph7.5 1M), 500mM NaCl (20ml de nacl 5M), 0.1 mM EDTA (40µl EDTA 0.5M), 0.1%triton (2ml de triton 10%). Volume final 200ml à compléter avec 174 ml eau

- tampon de clivage : 20mM Tris-HCl ph 8 (1ml de tris 1M), 50mM NaCl (5ml de nacl 5M), 0.1 mM EDTA (10µl EDTA 0.5M) 30 mM dithiothréitol DTT (1.5ml de DTT 1M). Preparation du DTT 1M 0.77g pour 5ml de DTT

Gel SDS page, pour chaque échantillon faire

- Extrait brute après sonication.

- Fraction soluble après centrifugation 4°C, 4000g

- Flowthrought

- Fraction d’élution après passage de tampon de clivage.

Clivage à 4°C : la proteine avec le tag intéine, clivage grâce à la réduction du DTT. L’inteine se fixe sur les billes de chitine, car elle possède un domaine de fixation à la chitine.

Protocole :

- Ajouter du trition 0.1% 100X après la sonication. (400µl de triton 10% X100)

- Sonication à froid. (4cycle avec tous les paramètres a 4, output 4, cycle duty 4)

- Reprendre les extraits brutes induit / et non induit dans 20 µl

- Centrifuger après la centrifugation 12000g, 30 min et filtrer à 0.45µm

- Garder le culot à -20°C

- Garder 40µl de surnageant + bleu de laemmli 4X

Equilibration de la colonne :

- ajouter 6 ml de bille de chitine

- équilibrer avec 60 ml de tp de lavage

- ajouter le surnageant après la centrifugation et la filtration

- Prendre 40µl de flowthrought + bleu de laemmili 4X

Lavage de la colonne :

- laver avec 100 ml de tp de lavage

- prendre 40µl de flowthrought + bleu de laemmli 4X

Clivage :

- laver avec 18 ml de tp de clivage ou 3 volume de colonne

- prendre 40 µl de Flowthrought + 20 µl de bleu de laemmili

- Stopper le flux et laisser à 4°C O/N

Elution :

- laver avec du tp de lavage, 3 volumes de colonne

- prendre 40 µl + 20 µl de bleu de laemmili

- Faire les gels SDS-page.

Régénération de la colonne :

- laver la colonne avec 3 volumes de 1% SDS, suivi de 5 volumes de H2O, puis 5 volumes de tp de lavage.