Préparation d'un vecteur en vue du clonage :
- Transformation du vecteur dans des bactéries Xl1Blue
- Préparer 4 pré cultures de 10ml en milieu 2YT sélectif
- Miniprep sur les pré cultures (midiprep de préférence et éluer dans 100µl d'H2O)
- Eluer dans 4 X 50µl d'eau stérile pH 7.5
- Mesurer la concentration
- Digestion du vecteur, il faut essayer d'avoir 5µg de vecteur, rajouter les enzymes 1µl, le tampon 10X, la BSA 100X, avec un qsp à 50µl ou 100µl dépend du volume de vecteur a rajouter.
- Digestion O/N à 37°C de 18h à 9h
Réaction de déphosphorylation
- ne pas ajouter 10µl de Tp 10X SAP au 100µl ou 50µl de vecteur purifié
- 2µl de phosphatase de crevette
- 2h à 37°C
- inactivation de l'enzyme SAP 15min à 65°C
- Déposer la totalité du produit de digestion déphosphorylé sur gel d'agarose 1%, 100µl + 10µl de loading buffer
- Découpage des bandes correspondant au vecteur, pour éliminer l'insert, attention à bien nettoyer la lame avec de l'éthanol 70%, si on veut purifier plusieurs vecteurs différents, afin d'éviter les contaminations croisées
- Utillisation du kit Qiagen Gel Extraction
- Elution dans 30µl d'eau stérile
1 commentaire:
Préparation des vecteurs pET28a / pET21a / pET9 / pKHS / rpl24 en vue d'un clonage, pour cela je suis ce protocole, avec quelques modifications, quantité de vecteur 5µg pas 7µg, 3µl d'enzyme pas 4µl, et qsp 50µl pour la digestion du vecteur, après la digestion je passe à l'étape de déphosphorylation, en ajoutant pas le tp 10X SAP, apres j'inactive l'enzyme SAP 15min à 65°C, puis découpage des bandes, élution dans 30µl pas 2 X 50µl
Il me faut :
- pET28a Nco1 / Not1
- pET21a Nhe1/ Not1
- pET9 Nde1 / Not1
- pKHS Nco1 / Not1
- rpl24 Eag1 / Not1
- pKHS Eag1 / Not1
- pETM30 Nco1 / EcoR1 pas fait car je n'avais pas le vecteur, demander à Marc B
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