Généralités sur le Nanodrop et le bioanalyseur

cliquez ici

Protocole Amplification Ambion illumina

Quantité d’ARNt recommandé pour l’amplification (50-500 ng) le mieux c’est 200 ng

1. Synthèse du premier brin d’ADNc :

Dans la glace

Déposer un volume maximal de 5,5µl d’ARN totaux dans un microtube 0,2ml stérile Rnase-Free.
Ajouter de l’eau nucléase free pour compléter à 5,5µl si nécessaire.

Décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légèrement si nécessaire.

A température ambiante assembler dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 oligo (dT) Primer	0.5	3.2
10X First Strand Buffer	1	6.3
dNTP Mix	2	12.6
Rnase Inhibitor	0.5	3.2
ArrayScript	0.5	3.2
Total (µl)	4.5	28.5

Use 4,5µl of Reverse Transcription Master Mix per reaction.

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 4,5µl de Mix dans chaque tube (Vf=10µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h à 42°C (thermocycleur + couvercle chauffant non fermé)
⇒ Glace

2. Synthèse du second brin d’ADNc :

10 minutes avant la fin du programme PCR (2h à 42°C), décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légerement si nécessaire.

Dans la glace ajouter dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
Nuclease Free Water	31.5	198.5
10X Second Strand Buffer	5	31.5
dNTP Mix	2	12.6
DNA Polymérase	1	6.3
Rnase H	0.5	3.2
Total (µl)	40	252.1

Use 40µl of second Strand Master Mix per reaction

Mélanger le MIX en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 40µl de Mix dans chaque tube (Vf = 50µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brievement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h 16°C (thermocycleur sans couvercle chauffant).
⇒ Glace (l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

3. Purification de l’ADNc :

Apres purification, on peut mettre à -20°C
Speed Vacquer les échantillons 1h15 min pour les sécher complètement.

Une fois speed vacquer :
- Ajouter 8,75 µl d’eau Nucléase Free à 50°C au culot SpeedVacqué ( l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

4. Transcription in vitro :

A tempétature ambiante ajouter dans l’ordre suivant dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 10X Reaction Buffer	1.25	8
T7 Enzyme Mix	1.25	8
Biotin-16-UTP	1.25	8
Total (µl)	40	24

Use 3,75 µl of IVT Master Mix per reaction

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 3,75µl de Mix dans chaque tube (Vf = 12,5µl)
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube

⇒ 4H - 14h à 37°C
⇒ Stopper la réaction avec 87,5µl d’eau nucléase free. (Vf=100µl)

5. Purification des ARNa :

⇒ Nanodrop

Protocole Gradient de ficoll

Protocole Gradient de Ficoll :

Objectif :

Sert à isoler les lymphocytes et les monocytes fonctionnels. On va avoir 3 phases, avec en haut : le plasma avec les plaquettes, au milieu un anneau de lymphocytes et de monocytes, et en bas les erythrocytes et granulocytes. Avec cette technique on récupère environ 60 % plus ou moins 20 % des lymphocytes et 90 % sont viables.

- Si on pars de 3 tubes ACD (A = 16X100 10ml, il existe des B 13X100 7ml)(Acide citrique Citrate Dextrose), on pool les 3 tubes dans un corning de 50 ml, on aura environ 30 ml de sang.

- On ajoute jusqu'à 35 ml de NaCl 0,9 % pour diluer le sang et ainsi éviter que des lymphocytes précipite avec l'agrégation des érythrocytes et ainsi diminue le rendement de purification des lymphocytes. (attention l’agrégation des érythrocytes augmente à 37°C). Température idéale 18 - 20°C.

- Dans un nouveau Corning de 50 ml on ajouter 15 ml de Ficoll (préalablement réchauffer car le temps de sédimentation augmente si la température diminue), attention en ajoutant le sang il ne doit pas se mélanger avec le ficoll. Il faut incliner le tube de 45° et pipetter très doucement.

- Centrifuger à 2200 g pendant 30 min (ou 20 min ou même 15 min) à température ambiante. Attention il faut enlever le frein de la centrifugeuse en fin de run, il faut compter 30 min pour qu’elle s'arrête.

- Enlever la phase contenant le plasma mais laisser 5 ml environ, avec une pipette de 10 ml prendre l’anneau contenant les lymphocytes et les monocytes (on aura un peu de plasma et de plaquettes mais on les éliminera ensuite lors du lavage), et le placer dans un Corning de 15ml.

Récupération des culots secs et des cellules et sérum :

- Centrifuger 1700g pendant 10 min.

- Lavage avec 2 ml de milieu RPMI 10% SVF + supplément 5 ml glutamine / 5 ml acide aminés non essentiels / 5 ml  de pyruvate / 5 ml antibiotiques myco / pour éliminer le plasma et les plaquettes qui restaient lors de la récupération du culot et centrifuger 5 min a 1500g.

- Enlever le surnageant et reprendre dans 2 ml de SVF, séparer en 2 fois 500 µl (dans des tubes eppendorf) pour les culots secs (centrifuger 1500 g pendant 5 min) et laisser 1ml de SVF dans le Corning et en ensuite rajouter 1ml de SVF 20% DMSO (cryoprotectant des cellules pour les remettre en culture plutard), et ensuite mettre 1ml dans chacune des 2 ampoules oranges et les garder 24h à -80°C puis les mettre dans un canistère).

***pour le sérum centrifuger 10 min à 2000 g puis mettre dans des ampoules oranges ( préalablement refroidi ) à -20°***.

Important à faire avant :

- faire chauffer le SVF à 56°C pendant 30 min pour le décomplémenter. Décomplémentation du SVF : permet d'inactiver le complément qui pourrait détruire les cellules dans le cas où le SVF contiendrait des Ac pouvant reconnaître les cellules cultivées (activation de la voie classique). Décomplémentation réalisée par chauffage 30 minutes à 56°C puis centrifugation afin d'éliminer les éventuelles protéines dénaturées qui ont précipité.

Inconvénients du SVF : peut contenir des contaminants, mycoplasmes notamment, prix élevé,

problèmes de lots impliquant des essais préalables. Risques biologiques : présence possible d'agents infectieux : virus transmissibles à l'Homme, prions.

- refroidir les ampoules oranges avant de mettre les cellules avec du DMSO.

Protocole utilisation Bioanalyseur

PROTOCOLE Agilent PUCE Nano 6000 RNA

- Préchauffer un bloc à 70°C pour dénaturer les échantillons
- Garder les réactifs à RT 30min avant
- Vérifier la date du gel matrice filtré (1mois) sinon en refaire (550 µl de RNA 6000 Nano gel matrice dans un tube filtré
- Centrifuger le gel matrice 10 min à 4000 rpm
- Préparer 130 µl de gel filtrer + 2µl de dye (vortexer avant 10sec minimum)=> gel dye (bien vortexer 10sec minimum/ valable 1 semaine)
- Centrifuger le gel dye 10 min à 13000g (ne plus vortexer après cette étape)
- Prendre un aliquote de 1µl d’ARN
- Demander le ladder
- Dénaturer les échantillons + le ladder à 70°C pendant 2min, et ne pas remettre dans la glace
- Centrifuger pour tomber les gouttes

Injecter les échantillons sur la puce :

- Vérifier la position de la base ARN
- Fixer la seringue sur le couvercle
- Déposer 9 µl de gel dye dans le puits noté G
- Pressuriser : monter le piston de la seringue sur 1ml, bloquer le piston à la position max, laisser 30 sec, débloquer le piston et laisser ce dernier remonter tout seul (au dessus de 0,8 ml bon indicateur de l'absence de microfuite), ouvrir le couvercle délicatement pour éviter de faire tomber la puce
- Ajouter 9 µl de gel dye dans les 2 autres puits noté G
- Ajouter 5 µl de RNA marqueur dans tous les puits sauf là où il y a le gel dye et 6 µl dans les puits vides
- Ajouter 1µl de ladder dans les puits marqué avec une échelle
- Ajouter 1µl d’échantillon en suivant l’ordre de la puce
- Vortexer 1 min à 2000 rpm, en appuyant sur le bouton rond START

Nettoyage du bioanalyseur : a faire avant et après le run

- Dans les puces de nettoyage, ajouter 350µl de RNAse ZAP
- Laisser agir 1 min
- Rincer avec 350µl d’eau
- Laisser agir 30 sec
- Laisser sécher à l’air libre pendant 1 min

Ordinateur :

- User name : P3S
- Double clic sur Agilent 2100 Expert
- Installer la puce et fermer le couvercle, aller dans assay et choisir le type d’analyse
- Cliquer sur Start
- Dans l’icone DATA rentrer le nom des échantillons
Après lecture
- Refaire un lavage avec la RNASE Zap pendant 1 min
- Refaire le lavage à l’eau pendant 30sec

Print : Run summary, l’electropherogram, gel like, et le result table.

voir ce pdf pour plus de détails : cliquer ici

Faire le pH d'une solution de Tris

How to pH a solution

All solutions with defined pHs should be checked using the pH meter. pH paper is not accurate enough! The pH should be accurate to within 0.1 pH units.

If you are not sure how much acid or base you will need, make up the solution in a volume smaller than the final volume (e.g. 800 ml for 1 liter), adjust the pH and then bring to the final volume.

To adjust pH, use concentrated HCl (strong acid, kept in the Acids cabinet) or 10 N NaOH (strong base). You can also use dilute HCl (1 M) or 1 N NaOH for fine adjustment of pH. Don’t use NaOH pellets unless specified.

Adjust pH while the solution is being stirred in a beaker. Add the acid or base in small increments and check pH after each increment so as not to overshoot.

Concentrated HCl is a 37% solution (~11 M). To make 1 M HCl, dilute 86.5 ml of conc. HCl in 1 liter dH₂O.

Préparation du running buffer pour les gels SDS

Il faut un tampon tris glycine 5x par exemple et mettre du SDS en poudre ou en liquide à 0.1% pour 1L

Exemple de solution complète avec le SDS :

5 X SDS-PAGE Gel Running Buffer

15.1 g Tris base
72.0 g glycine
5.0 g SDS
Bring to 1 liter with distilled water and dissolve. * Store at room temperature 1 month.

Sequence pour tag 6xHIs

Sequence nucléotidique pour tag 6xHis : à respecter pour ne pas affecter la machinerie de transcription de E.coli

CAC CAC CAT CAT CAC CAT