Protocole utilisation Bioanalyseur

PROTOCOLE Agilent PUCE Nano 6000 RNA

- Préchauffer un bloc à 70°C pour dénaturer les échantillons
- Garder les réactifs à RT 30min avant
- Vérifier la date du gel matrice filtré (1mois) sinon en refaire (550 µl de RNA 6000 Nano gel matrice dans un tube filtré
- Centrifuger le gel matrice 10 min à 4000 rpm
- Préparer 130 µl de gel filtrer + 2µl de dye (vortexer avant 10sec minimum)=> gel dye (bien vortexer 10sec minimum/ valable 1 semaine)
- Centrifuger le gel dye 10 min à 13000g (ne plus vortexer après cette étape)
- Prendre un aliquote de 1µl d’ARN
- Demander le ladder
- Dénaturer les échantillons + le ladder à 70°C pendant 2min, et ne pas remettre dans la glace
- Centrifuger pour tomber les gouttes

Injecter les échantillons sur la puce :

- Vérifier la position de la base ARN
- Fixer la seringue sur le couvercle
- Déposer 9 µl de gel dye dans le puits noté G
- Pressuriser : monter le piston de la seringue sur 1ml, bloquer le piston à la position max, laisser 30 sec, débloquer le piston et laisser ce dernier remonter tout seul (au dessus de 0,8 ml bon indicateur de l'absence de microfuite), ouvrir le couvercle délicatement pour éviter de faire tomber la puce
- Ajouter 9 µl de gel dye dans les 2 autres puits noté G
- Ajouter 5 µl de RNA marqueur dans tous les puits sauf là où il y a le gel dye et 6 µl dans les puits vides
- Ajouter 1µl de ladder dans les puits marqué avec une échelle
- Ajouter 1µl d’échantillon en suivant l’ordre de la puce
- Vortexer 1 min à 2000 rpm, en appuyant sur le bouton rond START

Nettoyage du bioanalyseur : a faire avant et après le run

- Dans les puces de nettoyage, ajouter 350µl de RNAse ZAP
- Laisser agir 1 min
- Rincer avec 350µl d’eau
- Laisser agir 30 sec
- Laisser sécher à l’air libre pendant 1 min

Ordinateur :

- User name : P3S
- Double clic sur Agilent 2100 Expert
- Installer la puce et fermer le couvercle, aller dans assay et choisir le type d’analyse
- Cliquer sur Start
- Dans l’icone DATA rentrer le nom des échantillons
Après lecture
- Refaire un lavage avec la RNASE Zap pendant 1 min
- Refaire le lavage à l’eau pendant 30sec

Print : Run summary, l’electropherogram, gel like, et le result table.

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