Protocole Gradient de ficoll

Protocole Gradient de Ficoll :

Objectif :

Sert à isoler les lymphocytes et les monocytes fonctionnels. On va avoir 3 phases, avec en haut : le plasma avec les plaquettes, au milieu un anneau de lymphocytes et de monocytes, et en bas les erythrocytes et granulocytes. Avec cette technique on récupère environ 60 % plus ou moins 20 % des lymphocytes et 90 % sont viables.

- Si on pars de 3 tubes ACD (A = 16X100 10ml, il existe des B 13X100 7ml)(Acide citrique Citrate Dextrose), on pool les 3 tubes dans un corning de 50 ml, on aura environ 30 ml de sang.

- On ajoute jusqu'à 35 ml de NaCl 0,9 % pour diluer le sang et ainsi éviter que des lymphocytes précipite avec l'agrégation des érythrocytes et ainsi diminue le rendement de purification des lymphocytes. (attention l’agrégation des érythrocytes augmente à 37°C). Température idéale 18 - 20°C.

- Dans un nouveau Corning de 50 ml on ajouter 15 ml de Ficoll (préalablement réchauffer car le temps de sédimentation augmente si la température diminue), attention en ajoutant le sang il ne doit pas se mélanger avec le ficoll. Il faut incliner le tube de 45° et pipetter très doucement.

- Centrifuger à 2200 g pendant 30 min (ou 20 min ou même 15 min) à température ambiante. Attention il faut enlever le frein de la centrifugeuse en fin de run, il faut compter 30 min pour qu’elle s'arrête.

- Enlever la phase contenant le plasma mais laisser 5 ml environ, avec une pipette de 10 ml prendre l’anneau contenant les lymphocytes et les monocytes (on aura un peu de plasma et de plaquettes mais on les éliminera ensuite lors du lavage), et le placer dans un Corning de 15ml.

Récupération des culots secs et des cellules et sérum :

- Centrifuger 1700g pendant 10 min.

- Lavage avec 2 ml de milieu RPMI 10% SVF + supplément 5 ml glutamine / 5 ml acide aminés non essentiels / 5 ml  de pyruvate / 5 ml antibiotiques myco / pour éliminer le plasma et les plaquettes qui restaient lors de la récupération du culot et centrifuger 5 min a 1500g.

- Enlever le surnageant et reprendre dans 2 ml de SVF, séparer en 2 fois 500 µl (dans des tubes eppendorf) pour les culots secs (centrifuger 1500 g pendant 5 min) et laisser 1ml de SVF dans le Corning et en ensuite rajouter 1ml de SVF 20% DMSO (cryoprotectant des cellules pour les remettre en culture plutard), et ensuite mettre 1ml dans chacune des 2 ampoules oranges et les garder 24h à -80°C puis les mettre dans un canistère).

***pour le sérum centrifuger 10 min à 2000 g puis mettre dans des ampoules oranges ( préalablement refroidi ) à -20°***.

Important à faire avant :

- faire chauffer le SVF à 56°C pendant 30 min pour le décomplémenter. Décomplémentation du SVF : permet d'inactiver le complément qui pourrait détruire les cellules dans le cas où le SVF contiendrait des Ac pouvant reconnaître les cellules cultivées (activation de la voie classique). Décomplémentation réalisée par chauffage 30 minutes à 56°C puis centrifugation afin d'éliminer les éventuelles protéines dénaturées qui ont précipité.

Inconvénients du SVF : peut contenir des contaminants, mycoplasmes notamment, prix élevé,

problèmes de lots impliquant des essais préalables. Risques biologiques : présence possible d'agents infectieux : virus transmissibles à l'Homme, prions.

- refroidir les ampoules oranges avant de mettre les cellules avec du DMSO.