Préparation de milieu RPMI

- On prend une bouteille de RPMI 500 ml

- On va décomplementer du SVF ( en le chauffant à 55°C pendant 30 min )
- Ensuite on va préparer le supplément qui contient : Cf dans le RPMI donc 500ml
Acide aminés non essentiels 100X --> 5ml
Antibiotiques 100X  --> 5ml
L-glutamine 100X (Ci=200mM) --> Cf=2mM donc 5ml

Sodium pyruvate (Ci=100mM) --> Cf=1mM donc 5ml

- On enleve 70ml de RPMI de sa bouteille de 500ml et on rajoute les :
50ml de SVF décomplémenter
20 ml de supplément

Préparer oligos lyophilisé

Vous voulez votre oligo à 200µM c'est à dire à 200µmoles/L c'est à dire à 200nmoles/mL. On pousse un petit peu plus loin le vice et on voit qu'il vous fait 2nmole/10µL. Vous avez 51.6nmol par exemple, il vous faut diviser par 2 puis X10 pour avoir le résultat en µl.

Préparation de boite LB agar

1.                  Microwave method for 100 mL agar (about 6 x 10 cm Petrie dishes)

2.                  Use 1 liter Pyrex beaker

3.                  Weigh out LB-agar powder and add sufficient water

a.       2.75 grams per 100 mL water

b.      Mix thoroughly by swirling

4.                  Cover top with plastic wrap (2 layers) and punch 5-10 holes in top to allow venting

5.                  Microwave on high until it just starts boiling (about 1 min)

6.                  Need to boil for at least 1 minute to sterilize

a.       Hit “beverage” key once after it starts to boil

7.                  VERY HOT!!

a.       Use orange hot mitts

b.      Always hold beaker with 2 hands

8.                  Sit on bench until cooled down

a.       Generally 5-10 min

b.      When can touch without getting burnt

9.                  Once cool (not set) add antibiotic of choice

a.       Ampicillin (final conc = 100 ug / mL)

                                                              i.      Add 100 uL of 100 mg/mL sterile solution per 100 mL agar

10.              Mix by swirling

11.              Pour into sterile Petrie dishes

a.       Need enough to cover bottom

b.      About 15-20 mL per regular (10 cm) dish

c.       Apply dish cover with one edge slightly ajar to allow venting

12.              Allow to set and dry out for several hours to overnight at room temperature

13.              Label and store in refrigerator for up to 2 weeks

PCR SOEing (synthesis by overlap extension)

PCR SOEing (synthesis by overlap extension)

This PCR based protocol is designed to attach two separate PCR products together that have been designed to have a short overlap of complementary sequence (typically 30 – 60 bp).  This overlap can be produced by the addition of bases to the ends of the internal primers for the respective PCR products.

For example:

                                   

5’ TGTAATTTCGTTTTATGCGCAGTTTTGGCTAGCCTGACACTTATCGGCTTTATCTGCTTA 3’

3’ ACATTAAAGCAAAATACGCGTCAAAACCGATCGGACTGTGAATAGCCGAAATAGACGAAT 5’

The red sequences are essentially the sequences of your forward and reverse primers for the separate PCR products.

1.) The first order of business is to amplify the separate PCR products to be combined and purify them following agarose gel electrophoresis.

2.) Generic SOE PCR

Need to make up two separate master mixes called A and B and store on ice.

                                                  Master mix A                        Master mix B

5X Phusion Buffer                           5.0 ul                                   5.0 ul

2.5 mM dNTPs                                2.0 ul                                    2.0 ul                   

Phusion polymerase                        .25 ul                                    .25 ul

10uM External Fwd Primer               0 ul                                    5.0 ul

10uM External Rvs Primer                0 ul                                    5.0 ul

Sterile milli-Q                             12.75 ul                                  7.75 ul 

Total                                              20.0 ul                                  25.0 ul

1.      Prepare DNA templates.  Assuming a relatively successful PCR for each of the two PCR products, I add around 1 ul of each template to a PCR tube.  If one PCR product was in lesser amount, I will compensate by adding another 1-2 ul of it.  Then add sterile milli-Q to achieve a total volume of 5 ul for each SOE reaction.  Set up a similar reaction but with the PCR products diluted ten-fold (for example add 45 ul of sterile milli-Q to a similar 5 ul of combined templates.

2.      Add 20 ul of Master Mix A to 5 ul volume of combined PCR templates and run these 25 ul reactions for the first 10 cycles (Maker a program called something like SOE PCR) in a PCR SOEing program. 

             SOE PCR (a typical program for a desired product less than 2 kb in size)

             1.  94^oC for 5 minutes.

             2.  94^oCfor 30 seconds

             3.  60^oC for 1.5 minutes

             4.  72^oC for 2.5 minutes

             5.  Repeat steps 2-4 ten times.

             6.  Hold at 10 ^oC for ten minutes (window of time to add mix B)

             7.  94 ^oC for 30 seconds

             8.  58 ^oC for 30 seconds

             9.  72 ^oC for 2 minutes

             10.  Repeat steps 7-9 thirty five times

             11.  Hold at 72 ^oC for 10 minutes

             12.  Hold at 10 ^oC indefinitely.

3.      After 10 cycles, add 25 ul of Master Mix B to the appropriate tubes.  Mix B includes the external primers that are needed to initiate the exponential increase of the SOE PCR product. 

4.      Run SOE PCRs on a preparative gel to isolate the product running at the expected size for the combination of the individual pieces.

Préparation de dNTP

voir le schéma ci dessous

Extraction d'ARN avec le Trizol

voir le protocole d'extraction du trizol cliquer ici

Description 

TRIzol® Reagent is a ready-to-use reagent, designed to isolate high quality total RNA (as well as DNA and proteins) from cell and tissue samples of human, animal, plant, yeast, or bacterial origin, within one hour. TRlzol® Reagent is a monophasic solution of phenol, guanidine isothiocyanate, and other proprietary components which facilitate the isolation of a variety of RNA spedes of large or small molecular size. TRIzol® Reagent maintains the integrity of the RNA due to higMy effective inhibition of RNase activity while disrupting cells and dissolving cell components during sample homogenization. TRIzol®Reagent allows for simultaneous processing of a large number of samples, and is an improvement to the single-step RNA isolation method developed by Chomcynski and Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 1987).

 TRIzol® Reagent allows the user to perform sequential précipitation of RNA, DNA, and proteins from a single sample (Chomczynski, 1993). After homogenizing the sample with TRIzol® Reagent, chloroform is added, and the homogenate is allowed to separate into a clear upper aqueous layer (containing RNA), an interphase, and a red lower organic layer (containing the DNA and proteins). RNA is precipitated from the aqueous layer with isopropanol. DNA is precipitated from the interphase/organic layer with ethanol. Protein is precipitated from the phenol-ethanol supernatant by isopropanol preipitation. The precipitated RNA, DNA, or protein is washed to remove impurities, and then resuspended for use in downstream applications.

• Isolated RNA can be used in RT-PCR, Northern Blot analysis. Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. 

• Isolated DNA can be used in PCR, Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. 

• Isolated protein can be used for Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation. 

RNA Isolation Procedure 

Always use the appropriate precautions to avoid RNase contamination when preparing and handling RNA. 

RNA précipitation 

l. (Optional) When precipitating RNA from small sample quantities (<=10^6 cells or <10 mg tissue), add 5-10 µg of RNase-free glycogen as a carrier to the aqueous phase. Note: Glycogen is co-precipitated with the RNA, but does not inhibit first-strand synthesis at concentrations <=4 mg/mL, and does not inhibit PCR. 

2. Add 0.5 mL of 100% isopropanol to the aqueous phase, per l m L of TRIzol® Reagent used for homogenization. 

 3. Incubate at room temperature for 10 minutes. 

 4. Centrifuge at 12/000 x g for 10 minutes at 4°C. Note: The RNA is often invisible prior to centrifugation, and forms a gel-like pellet on the side and bottom of the tube. 

5. Proceed to RNA wash.

RNA wash 

1. Remove the supenatant from the tube, leaving only the RNA pellet. 

2. Wash the pellet, with 1 mL of 75% ethanol per l mL of TRIzol® Reagent used in the initial homogenization. Note: The RNA can be stored in 75% ethanol at least l year at -20°C/ or at least 1 week at 4°C. 

3. Vortex the sample briefly, then centrifuge the tube at 7500 x g for 5 minutes at 4°C. Discard the wash. 

4. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5-10 minutes. Do not dry the pellet by vacuum centrifuge. Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility. Partially dissolved RNA samples have an A260/280 ratio <1.6. 

5. Proceed to RNA resuspension.

RNA resuspension 

l. Resuspend the RNA pellet in RNase-free water or 0.5% SOS solution (20-50 yL) by passing the solution up and down several times through a pipette tip. Note: Do not dissolve the RNA in 0.5% SDS if it is to be used in subsequent enzymatic reactions. 

2. Incubate in a water bath or heat block set at 55-60°C for 10-15 minutes. 

3. Proceed to downstream application, or store at -70°C

Principe PCR

Historique :

Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN. 

Principe :

La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle.
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. (1) Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin ;  (2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.

Pour réaliser une amplification sélective du fragment recherché, l’expérimentateur va  devoir optimiser les conditions expérimentales. Dans les chapitres suivants, vous trouverez quelques informations pour comprendre les critères et les limites dans le choix des différents paramètres. 

Les amorces :

Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Les oligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :

• des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température,
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
• des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).

Il est alors possible de faire synthétiser les deux oligonucléotides (d'une vingtaine de bases). La synthèse chimique d'ADN permet d'obtenir des oligonucléotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée (5'OH) contrairement aux ADN "dits" naturels. Ainsi, tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont déphosphorylés à leurs extrémités 5' 

Les températures :

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique :

• l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.
• l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces / matrice est réalisé.
• l’étape de polymérisation est à environ 72°C, température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées.

Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque nouvelle PCR. Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases des oligonucléotides amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation.
Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

(où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l’oligonucléotide). 

L’ADN matriciel :

En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante pour avoir une amplification, il faut cependant tenir compte de la probabilité de « rencontre » des molécules d’ADN matrice avec les amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Mais attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés dans les protocoles d’extraction d’ADN. 

L’ADN polymérase :

Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles. 

Le tampon :

Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg²⁺, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg²⁺ et de cations monovalents (K⁺ ou NH₄⁺) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.

Conditions expérimentales

En début d’expérience il y a un large excès d’oligonucléotides amorces ainsi que des dNTP en quantité suffisante pour synthétiser les copies d’ADN. La concentration en ADN est très faible. La difficulté en début d’expérience se situera essentiellement au niveau de la probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN matrice. Au fur et à mesure de l'avancée de la PCR, les copies d’ADN s’accumulent. Cette augmentation de la quantité d'ADN s'accompagne de modification du milieu réactionnel. La viscosité du milieu réactionnel augmente, les quantités d’oligonucléotides amorces et de dNTP diminuent. De plus, la synthèse d’ADN est accompagnée de la libération d’ions pyrophosphates qui en concentration élevée inhibent l’activité de la Taq polymérase. En fin d'expérience PCR, les conditions expérimentales auront changé jusqu'à devenir de plus en plus défavorables à une bonne activité enzymatique. On peut comprendre alors que le nombre de cycles lors d'une expérience PCR soit limité (généralement entre 30 et 40 cycles). 

Aspects quantitatifs de la réaction PCR :

Le nombre de cycle est défini par l’expérimentateur selon le degré d’amplification souhaité, dans la plupart des cas, ce nombre est d’environ 30. En théorie (et seulement en théorie!) il y a un facteur d’amplification de l’ordre de 2³⁰ soit un facteur d'un milliard. Nous avons vu dans le paragraphe précédent qu'en pratique les conditions expérimentales évoluent au fur et à mesure de l’avancée des cycles, le rendement de la réaction de polymérisation évolue de même, on peut espérer obtenir avec 30 à 40 cycles, un facteur d’amplification de l’ordre de 10⁵ à 10⁶.
L'animation suivante permet de suivre le nombre de copies synthétisée au cours d'une PCR de 30 cycles. La représentation graphique est réalisée avec une échelle semi-logarithmique. La quantité de copies "longues" d'ADN devient rapidement négligeable devant le nombre de copies d'ADN cible.