PCR Touchdown

PCR par essais (Touchdown PCR)

C’est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produit de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intêret devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais. 

RT PCR avec SuperScript 3

Introduction : 

Description SuperScript™ ID Reverse Transcriptase is an engineered version of M-MLV RT with reduced RNase H activity and mcreased thermal stability.

The enzyme is purified to near homogeneity from E. coli containing the modified pol gene of Moloney Murine Leukemia Virus (1,2). The enzyme can be used to synthesize first-strand cDNA at temperatures up to 55°C, providing increased specificity, higher yields of cDNA, and more full length product than other reverse transcriptases. It can generate cDNA from 100 bp to >12 kb.

First-Strand cDNA Synthesis :

The following 20 µl reaction volume can be used for 10 pg-5 pg of total RNA or 10pg-500ng of mRNA.

1. Add the following components to a nuclease-free microcentrifuge tube :
- l µl of oligo(dT)20 (50 pM); or 200-500 ng of oligo(dT)12-18, or 50-250 ng of random primers; or 2 pmol of gene-specific primer.
- 10 pg-5 µg total RNA or 10 pg-500 ng mRNA
- l µl 10 mM dNTP Mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH)
Stérile, distilled water to 13 µl

2. Heat mixture to 65°C for 5 minutes and incubate on ice for at least 1 minute

3. Collect the contents of the tube by brief centrifugation and add:
- 4 µL 5X First-Strand Buffer
- l µl 0.1 M DTT
- l µl RNaseOUT (Recombinant RNase Inhibitor. Note: When using less than 50 ng of starting RNA, the addition of RNaseOuT is essential.
- l µL of SuperScript 3 RT (200 units/µl) *If generating cDNA longer than 5 kb at temperatures above 50°C using a gene-specific primer or oligo(dT)20, the amount of SuperScript may be raised to 400 U (2 µl) to increase yield.

4. Mix by pipetting gently up and down. If using random primers, incubate tube at 25°C for 5 minutes.

5. Incubate at 50°C for 30-60 minutes. Increase the reaction temperature to 55°C for gene-spedfic primer. Reaction temperature may also be increased to 55°C for difficult templates or templates with high secondary structure.

6. Inactivate the reaction by heating at 70°C for 15 minutes.

The cDNA can now be used as a template for amplification in PCR. However, amplification of some PCR targets (those >1 kb) may require the removal of RNA complementary to the cDNA. To remove RNA complementary to the cDNA, add l µl (2 units) of E.coli RNase H and incubate at 37°C for 20 minutes.

Protocole ILLUMINA TRANSCRIPTOME

(12-Samples)

(Hybridation des lames, lavage/blocage/détection/lavage/centrifugation et lecture)

JOUR  1 (hybridation / incubation / préparation du tampon High Temp Buffer)
Temps de manipe : environ 20 minutes (démarrer vers l 6h)
Temps d'incubation : 16-20 heures

 MATERIEL
 HYB 10µl/échantillon (-20°C)
1 pipette multicanal 0.1-10^1
1 rack stérile
HCB 400µl/lame (-20°C)
 10X High-Temp Wash buffer 50ml (Température ambiante)
1 Eprouvette de 500ml en verre
RNase free water 500ml
Parafilm
1 feutre!!! Les lames!!!

- Préparer les ARNa : déposer dans la glace 750ng d'ARNa qsp 5µl d'eau RNase-free. Utiliser des barrettes RNase free 0.2µl de 8 échantillons, à bouchon unique, 1 barrette pour une lame.

- Descendre sur la plateforme ilIumina.
- Préchauffer le four à hybridation à 58°C.
 - Déposer les Tubes HYB et HCB dans le four à 58°C durant 10 minutes pour dissoudre les sels précipités. (Si au bout de 10 minutes il reste des sels, remettre les tubes dans le four durant 10 autres minutes). Mélanger les tubes avant utilisation. '

- Ajouter 10µl de HYB à chaque ARNa avec la pipette multicanal après avoir déposé 500µl de HYB (pour 4 lames) dans un rack stérile à usage unique.
- Mélanger et centrifuger brièvement les échantillons.
- Fragmenter les échantillons 5 minutes à 65°C (thermocycleur BioRad, Cliquer sur RUN puis sélectionner le programme GEX65).
- Centrifuger brièvement les échantillons.

- Préparer la chambre à hybridation (Hyb chamber + Hyb Chamber gasket).
 - Déposer 200µl de HCB dans les réservoirs de la chambre à hybridation.
- Pour éviter l’évaporation du tampon HCB, fermer la chambre d'hybridation avec son couvercle le temps de procéder à hybridation.

 - Retirer les lames de leurs emballages (manipuler les lames du coté du code barre, avec des gants sans poudre ou à la pince).
 - Déposer les lames dans les Hyb Chamber Inserts dans le sens du code barre.
- Déposer les  15µl de l'échantillon. (Noter l'ordre des positions des 8 échantillons).
- Placer les lames + Hyb Chamber Inserts dans la Chambre à Hybridation.
- Fermer le couvercle de la chambre à hybridation (Attention de bien appuyer sur le couvercle en fermant les charnières)
-Incuber 16-20 h à 58°C dans le four à hybridation sous agitation (position 5).
- Préparer le 1X High-Temp Wash buffer en ajoutant 50ml du stock 10X dans 450 ml de RNase Free water)
- Placer le tampon dans le bloc chauffant à 55°C, fermer le bloc chauffant et laisser incuber toute la nuit.

JOUR 2 (lavage/blocage, détection/lavage/centrifugation)
Temps de manipe : environ 65 minutes (démarrer vers 10h)

MATERIEL
10X High-Temp Wash buffer 500ml (55°C, préparé la veille et incubé toute la nuit)
Block E1 buffer 6ml/lame (4°C)
 1 Falcon de 15ml
Wash E1BC 2L (Température ambiante)
 1 Bouteille de 2L
RNase free water 2 L
Strepatvidin-Cy3 2µl à 1 mg/ml par puce (-20°C)
Ethanol 100% 250ml (Température ambiante)
Pipette Boy!!
1 Feutre !!!

- Allumer le scanner en arrivant.

- Ajouter 6ml de E1BC buffer (=WBC) dans 2L d'eau RNase-free.

- Déposer dans le tube Falcon 2ml de Block E1buffer + 2µl de streptavidin-Cy3 à 1mg/ml (Si plusieurs lames, préparer dans le même tube). Placer le tube dans le noir jusqu'à utilisation.

- Mettre environ 750ml d’E1BC buffer dilué dans le cristallisoir.
- Retirer la chambre d'hybridation du four.
- Prendre la 1ere lame et la placer dans les 750ml de E1BC buffer dilué.
- Retirer le film de la lame en restant immergé.
- Placer la lame dans le portoir à lame (spotting vers l’extérieur) immergé dans 250ml d’E1BC buffer dilué.
- Procéder de la même façon pour toutes les lames.

- Plonger ensuite le portoir dans le block chauffant contenant le High-Temp buffer à 55°C, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 10 minutes avec le couvercle fermé.

- Durant l'incubation mettre 250 ml d’E1BC buffer dilué dans un plat transparent propre.
- Après les 10 minutes d'incubation, transférer immédiatement le portoir à lame dans les 250ml d’E1BC buffer dilué. Faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber  5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).
- Transférer le portoir à lame dans un plat transparent contenant 250ml d'E1BC, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 2 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer les lames dans les portoirs en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 4ml de E1 Block buffer et les déposer sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Placer les lames dans un nouveau portoir en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 2ml de E1 Block buffer + Strepatvidin-cy3 et déposer les sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer 250ml de E1BC buffer dilué dans un plat propre.
- Déposer les lames dans le portoir à lame et immerger le portoir dans le tampon E1BC buffer dilué, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Préparer la centrifugeuse : mettre du papier absorbant sur les plots qui vont être utilisés pour centrifuger les lames
- Déposer rapidement les lames dans deux portoirs à lame propres et centrifuger à 275g durant 4 minutes à 25°C.
- Scanner les lames

SCAN
- Allumer le scan au moins 30 min avant de scanner les lames.
- Mettre le CD correspondant à la lame dans l'ordinateur.
- Copier le dossier decode data de chaque CD dans my document/P3S’s Document/illumina/TiphaineTranscriptome/decode data.
- Dans le dossier TiphaineTranscriptome/sample sheet, créer une feuille de route Excel en.csv avec la position des échantillons sur la lame, le numéro de la lame, la date du scan...
- Ouvrir BeadStudio et vérifier sur la page d'accueil du site Illumina qu'il n'y a pas une nouvelle version du manifest de la lame HumanRef-8v2.
- Lancer le logiciel BeadScan.

Généralités sur le Nanodrop et le bioanalyseur

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Protocole Amplification Ambion illumina

Quantité d’ARNt recommandé pour l’amplification (50-500 ng) le mieux c’est 200 ng

1. Synthèse du premier brin d’ADNc :

Dans la glace

Déposer un volume maximal de 5,5µl d’ARN totaux dans un microtube 0,2ml stérile Rnase-Free.
Ajouter de l’eau nucléase free pour compléter à 5,5µl si nécessaire.

Décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légèrement si nécessaire.

A température ambiante assembler dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 oligo (dT) Primer	0.5	3.2
10X First Strand Buffer	1	6.3
dNTP Mix	2	12.6
Rnase Inhibitor	0.5	3.2
ArrayScript	0.5	3.2
Total (µl)	4.5	28.5

Use 4,5µl of Reverse Transcription Master Mix per reaction.

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 4,5µl de Mix dans chaque tube (Vf=10µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h à 42°C (thermocycleur + couvercle chauffant non fermé)
⇒ Glace

2. Synthèse du second brin d’ADNc :

10 minutes avant la fin du programme PCR (2h à 42°C), décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légerement si nécessaire.

Dans la glace ajouter dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
Nuclease Free Water	31.5	198.5
10X Second Strand Buffer	5	31.5
dNTP Mix	2	12.6
DNA Polymérase	1	6.3
Rnase H	0.5	3.2
Total (µl)	40	252.1

Use 40µl of second Strand Master Mix per reaction

Mélanger le MIX en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 40µl de Mix dans chaque tube (Vf = 50µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brievement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h 16°C (thermocycleur sans couvercle chauffant).
⇒ Glace (l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

3. Purification de l’ADNc :

Apres purification, on peut mettre à -20°C
Speed Vacquer les échantillons 1h15 min pour les sécher complètement.

Une fois speed vacquer :
- Ajouter 8,75 µl d’eau Nucléase Free à 50°C au culot SpeedVacqué ( l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

4. Transcription in vitro :

A tempétature ambiante ajouter dans l’ordre suivant dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 10X Reaction Buffer	1.25	8
T7 Enzyme Mix	1.25	8
Biotin-16-UTP	1.25	8
Total (µl)	40	24

Use 3,75 µl of IVT Master Mix per reaction

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 3,75µl de Mix dans chaque tube (Vf = 12,5µl)
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube

⇒ 4H - 14h à 37°C
⇒ Stopper la réaction avec 87,5µl d’eau nucléase free. (Vf=100µl)

5. Purification des ARNa :

⇒ Nanodrop

Protocole Gradient de ficoll

Protocole Gradient de Ficoll :

Objectif :

Sert à isoler les lymphocytes et les monocytes fonctionnels. On va avoir 3 phases, avec en haut : le plasma avec les plaquettes, au milieu un anneau de lymphocytes et de monocytes, et en bas les erythrocytes et granulocytes. Avec cette technique on récupère environ 60 % plus ou moins 20 % des lymphocytes et 90 % sont viables.

- Si on pars de 3 tubes ACD (A = 16X100 10ml, il existe des B 13X100 7ml)(Acide citrique Citrate Dextrose), on pool les 3 tubes dans un corning de 50 ml, on aura environ 30 ml de sang.

- On ajoute jusqu'à 35 ml de NaCl 0,9 % pour diluer le sang et ainsi éviter que des lymphocytes précipite avec l'agrégation des érythrocytes et ainsi diminue le rendement de purification des lymphocytes. (attention l’agrégation des érythrocytes augmente à 37°C). Température idéale 18 - 20°C.

- Dans un nouveau Corning de 50 ml on ajouter 15 ml de Ficoll (préalablement réchauffer car le temps de sédimentation augmente si la température diminue), attention en ajoutant le sang il ne doit pas se mélanger avec le ficoll. Il faut incliner le tube de 45° et pipetter très doucement.

- Centrifuger à 2200 g pendant 30 min (ou 20 min ou même 15 min) à température ambiante. Attention il faut enlever le frein de la centrifugeuse en fin de run, il faut compter 30 min pour qu’elle s'arrête.

- Enlever la phase contenant le plasma mais laisser 5 ml environ, avec une pipette de 10 ml prendre l’anneau contenant les lymphocytes et les monocytes (on aura un peu de plasma et de plaquettes mais on les éliminera ensuite lors du lavage), et le placer dans un Corning de 15ml.

Récupération des culots secs et des cellules et sérum :

- Centrifuger 1700g pendant 10 min.

- Lavage avec 2 ml de milieu RPMI 10% SVF + supplément 5 ml glutamine / 5 ml acide aminés non essentiels / 5 ml  de pyruvate / 5 ml antibiotiques myco / pour éliminer le plasma et les plaquettes qui restaient lors de la récupération du culot et centrifuger 5 min a 1500g.

- Enlever le surnageant et reprendre dans 2 ml de SVF, séparer en 2 fois 500 µl (dans des tubes eppendorf) pour les culots secs (centrifuger 1500 g pendant 5 min) et laisser 1ml de SVF dans le Corning et en ensuite rajouter 1ml de SVF 20% DMSO (cryoprotectant des cellules pour les remettre en culture plutard), et ensuite mettre 1ml dans chacune des 2 ampoules oranges et les garder 24h à -80°C puis les mettre dans un canistère).

***pour le sérum centrifuger 10 min à 2000 g puis mettre dans des ampoules oranges ( préalablement refroidi ) à -20°***.

Important à faire avant :

- faire chauffer le SVF à 56°C pendant 30 min pour le décomplémenter. Décomplémentation du SVF : permet d'inactiver le complément qui pourrait détruire les cellules dans le cas où le SVF contiendrait des Ac pouvant reconnaître les cellules cultivées (activation de la voie classique). Décomplémentation réalisée par chauffage 30 minutes à 56°C puis centrifugation afin d'éliminer les éventuelles protéines dénaturées qui ont précipité.

Inconvénients du SVF : peut contenir des contaminants, mycoplasmes notamment, prix élevé,

problèmes de lots impliquant des essais préalables. Risques biologiques : présence possible d'agents infectieux : virus transmissibles à l'Homme, prions.

- refroidir les ampoules oranges avant de mettre les cellules avec du DMSO.

Protocole utilisation Bioanalyseur

PROTOCOLE Agilent PUCE Nano 6000 RNA

- Préchauffer un bloc à 70°C pour dénaturer les échantillons
- Garder les réactifs à RT 30min avant
- Vérifier la date du gel matrice filtré (1mois) sinon en refaire (550 µl de RNA 6000 Nano gel matrice dans un tube filtré
- Centrifuger le gel matrice 10 min à 4000 rpm
- Préparer 130 µl de gel filtrer + 2µl de dye (vortexer avant 10sec minimum)=> gel dye (bien vortexer 10sec minimum/ valable 1 semaine)
- Centrifuger le gel dye 10 min à 13000g (ne plus vortexer après cette étape)
- Prendre un aliquote de 1µl d’ARN
- Demander le ladder
- Dénaturer les échantillons + le ladder à 70°C pendant 2min, et ne pas remettre dans la glace
- Centrifuger pour tomber les gouttes

Injecter les échantillons sur la puce :

- Vérifier la position de la base ARN
- Fixer la seringue sur le couvercle
- Déposer 9 µl de gel dye dans le puits noté G
- Pressuriser : monter le piston de la seringue sur 1ml, bloquer le piston à la position max, laisser 30 sec, débloquer le piston et laisser ce dernier remonter tout seul (au dessus de 0,8 ml bon indicateur de l'absence de microfuite), ouvrir le couvercle délicatement pour éviter de faire tomber la puce
- Ajouter 9 µl de gel dye dans les 2 autres puits noté G
- Ajouter 5 µl de RNA marqueur dans tous les puits sauf là où il y a le gel dye et 6 µl dans les puits vides
- Ajouter 1µl de ladder dans les puits marqué avec une échelle
- Ajouter 1µl d’échantillon en suivant l’ordre de la puce
- Vortexer 1 min à 2000 rpm, en appuyant sur le bouton rond START

Nettoyage du bioanalyseur : a faire avant et après le run

- Dans les puces de nettoyage, ajouter 350µl de RNAse ZAP
- Laisser agir 1 min
- Rincer avec 350µl d’eau
- Laisser agir 30 sec
- Laisser sécher à l’air libre pendant 1 min

Ordinateur :

- User name : P3S
- Double clic sur Agilent 2100 Expert
- Installer la puce et fermer le couvercle, aller dans assay et choisir le type d’analyse
- Cliquer sur Start
- Dans l’icone DATA rentrer le nom des échantillons
Après lecture
- Refaire un lavage avec la RNASE Zap pendant 1 min
- Refaire le lavage à l’eau pendant 30sec

Print : Run summary, l’electropherogram, gel like, et le result table.

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