Réaction controle de la réaction de ligation T4 DNA ligase

Procédure tri plasmocytes sur robot MACS miltenyi biotec

Avant chaque tri Préparer 2 bouteilles de 1litre de Running buffer stérile. PBS 1X pH 7.2 0,5 % BSA 2 mM EDTA stocker à + 4°C.

Préparer 1 litre d’ethanol 70% stérile.

Marquage plasmocytes :  vérifier la présence de plasmocytes CD19low CD27bright /CD19 au FACS. Si plasmocytes >5% procéder au tri.

Mesurer le volume final de sang total (réception des échantillons sur tube ACD-A)

Ajouter 50µl de Whole Blood CD138 MicroBeads (ref 130-093-062) par ml de sang total.
Homogéneiser par retournement et incuber 15 min a +4°C Laver avec 2 à 5 ml de Running buffer par ml de sang total ( aliquoter en conséquence). Puis centrifuger 10 min à 445g (environ 1500t) sans le FREIN Aspirer le surnageant en laissant 2 mm de buffer et sans aspirer de cellule en surface. Resuspendre de culot en ajoutant un volume de buffer pour un volume du culot  (ex si culot de 5 ml ajouter 5 ml de buffer) Attention : ne pas dépasser un volume final de 13ml car le robot procède a une dilution 1/3 dans l’automate qui stoppe le tri s’il ne peut faire cette dilution.

Procéder au tri sur automate. Matériel nécessaire : Running buffer   environ   2 litres / 50ml de sang total à trier
Ethanol 70%  Tubes de 50 ml pour recueillir la fraction négative et tube de 15ml pour recueillir les plasmocytes triés. Colonnes de tri  Gants.

En arrivant au robot, il faut vérifier que les bouteilles soient pleines et la poubelle du robot soit vide. Sinon : Remplir la bouteille de Wash solution (bouteille arrière à droite) si nécessaire. La Wash solution est déjà sur site (sous l’automate). Remplir la bouteille de running buffer (bouteille avant à droite). Remplir la bouteille d’éthanol 70% (bouteille arrière à gauche) si nécessaire. Vider la poubelle (bouteille avant à gauche) dans le bidon à déchets liquides biologiques.
Mettre l’appareil sous tension (bouton on/off en bas à droite du panneau latéral). L’automate s'initialise, puis sur le menu principal : Appuyer sur l’onglet STATUS Si la colonne apparaît en rouge, l’appareil vous demande de changer la colonne. Basculer le cache transparent du portoir vers vous et ouvrir le panneau en face de vous en le tirant, ouverture vers la droite.
Si l’appareil n’est pas utilisé, il se peut qu’il y ait des colonnes d’attentes (vides), à ne pas jeter lors du changement de colonnes 
Sortir les colonnes usagées du bloc noir et deviser les extrémités. Les remplacer par des colonnes neuves, viser les extrémités sur les tubulures et replacer les colonnes sur le bloc (bien enfoncer les colonnes sur les guides du bloc).
Refermer le panneau et basculer le cache transparent du portoir à sa position initiale et confirmer sur l’écran que les colonnes sont changées, un cycle Rinse se lance pour hydrater les colonnes. Nb : 1 colonne sert pour 50 tris et doit être changée tous les 15 jours.

Puis, appuyer sur l’onglet SEPARATION

Sélectionner les positions du portoir en appuyant dessus sur l’écran (de 1 à 6 selon portoir utilisé)    Programmer le prog de séparation (menu déroulant) : Sélectionner en cliquant sur l’écran Posselwb (Positive Selection Whole Blood).
Selectionner le lavage onglet wash : Qrinse entre deux échantillons d’un même patient, Rinse entre deux tris d’échantillon de patient différent. 
Sortir le portoir réfrigéré du frigo (en bas à droite de l’automate).
Positionner le portoir sur son emplacement mettre les tubes à trier.  
Lancer le Run en appuyant sur RUN.
En fin de tri, sortir les tubes du portoir, et ranger ce dernier à +4°C.,
lancer un WASH NOW.
Appuyer sur SLEEP puis sur          à l’écran et enfin éteindre l’automate.

Marquage des plasmocytes sur sang total

On utilise les anticorps suivant :
- CD27 PE ==> cellule memoire plasmocytaire
- CD19 APC ==> total des cellules B
- CD138 Per Cy5.5 ==> plasmocytes

combinaison des 3 ==> populations plasmocytaires

dans un tube à hémolyse on met :
- 10µl de CD138
- 10 µl de CD27
- 5 µl de CD19

dans la boite plasmo lyB
-  on met 200 µl de sang total dans le tube à hémolyse
- vortex
- 15 min dans le noir
- 4 ml de tp de lyse ( 10X au départ on l'utilise 1X) qui contient un agent de lyse et du paraformaldéhyde pour fixer les plasmocytes, on lyse les globules rouges car sinon au facs, on aurait un bruit de fond très important, car les globules rouges sont de grosses structures biconcaves et le rayon se dévier fréquemment.
- centrifugation 5 min 1500g, dans le culot on va avoir les lymphocytes et les granuleux.
- on jete le surnageant (élimination des globules rouges)
- lavage 2 ml de PBS BSA
- centrifugation 5 min 1500g
- élimination du surnageant
- on reprend dans 200µl de PBS BSA
- on passe au FACS, les plasmocytes sont CD19low CD27bright /CD19 au FACS, si population de plasmocytes en dessous de 5 % , abondonner

Ligation control

Controls should be run to test the cells and DNA when using T4 DNA Ligase?

1. Transforming uncut vector in the competent cells checks cell viability and tests the antibiotic resistance of the plasmid. Plate on media and media plus antibiotic.
2. Linearized vector tests for background due to uncleaved plasmid. Should be <1 1.="1.">
3. Cut and religated plasmid tests ligase activity and DNA end integrity. Should be near the value obtained in 1.
4. Cut, phosphatased, religated plasmid tests background due to incomplete phosphatase treatment. Should be <1>

Préparation de milieu RPMI

- On prend une bouteille de RPMI 500 ml

- On va décomplementer du SVF ( en le chauffant à 55°C pendant 30 min )
- Ensuite on va préparer le supplément qui contient : Cf dans le RPMI donc 500ml
Acide aminés non essentiels 100X --> 5ml
Antibiotiques 100X  --> 5ml
L-glutamine 100X (Ci=200mM) --> Cf=2mM donc 5ml

Sodium pyruvate (Ci=100mM) --> Cf=1mM donc 5ml

- On enleve 70ml de RPMI de sa bouteille de 500ml et on rajoute les :
50ml de SVF décomplémenter
20 ml de supplément

Préparer oligos lyophilisé

Vous voulez votre oligo à 200µM c'est à dire à 200µmoles/L c'est à dire à 200nmoles/mL. On pousse un petit peu plus loin le vice et on voit qu'il vous fait 2nmole/10µL. Vous avez 51.6nmol par exemple, il vous faut diviser par 2 puis X10 pour avoir le résultat en µl.

Préparation de boite LB agar

1.                  Microwave method for 100 mL agar (about 6 x 10 cm Petrie dishes)

2.                  Use 1 liter Pyrex beaker

3.                  Weigh out LB-agar powder and add sufficient water

a.       2.75 grams per 100 mL water

b.      Mix thoroughly by swirling

4.                  Cover top with plastic wrap (2 layers) and punch 5-10 holes in top to allow venting

5.                  Microwave on high until it just starts boiling (about 1 min)

6.                  Need to boil for at least 1 minute to sterilize

a.       Hit “beverage” key once after it starts to boil

7.                  VERY HOT!!

a.       Use orange hot mitts

b.      Always hold beaker with 2 hands

8.                  Sit on bench until cooled down

a.       Generally 5-10 min

b.      When can touch without getting burnt

9.                  Once cool (not set) add antibiotic of choice

a.       Ampicillin (final conc = 100 ug / mL)

                                                              i.      Add 100 uL of 100 mg/mL sterile solution per 100 mL agar

10.              Mix by swirling

11.              Pour into sterile Petrie dishes

a.       Need enough to cover bottom

b.      About 15-20 mL per regular (10 cm) dish

c.       Apply dish cover with one edge slightly ajar to allow venting

12.              Allow to set and dry out for several hours to overnight at room temperature

13.              Label and store in refrigerator for up to 2 weeks

PCR SOEing (synthesis by overlap extension)

PCR SOEing (synthesis by overlap extension)

This PCR based protocol is designed to attach two separate PCR products together that have been designed to have a short overlap of complementary sequence (typically 30 – 60 bp).  This overlap can be produced by the addition of bases to the ends of the internal primers for the respective PCR products.

For example:

                                   

5’ TGTAATTTCGTTTTATGCGCAGTTTTGGCTAGCCTGACACTTATCGGCTTTATCTGCTTA 3’

3’ ACATTAAAGCAAAATACGCGTCAAAACCGATCGGACTGTGAATAGCCGAAATAGACGAAT 5’

The red sequences are essentially the sequences of your forward and reverse primers for the separate PCR products.

1.) The first order of business is to amplify the separate PCR products to be combined and purify them following agarose gel electrophoresis.

2.) Generic SOE PCR

Need to make up two separate master mixes called A and B and store on ice.

                                                  Master mix A                        Master mix B

5X Phusion Buffer                           5.0 ul                                   5.0 ul

2.5 mM dNTPs                                2.0 ul                                    2.0 ul                   

Phusion polymerase                        .25 ul                                    .25 ul

10uM External Fwd Primer               0 ul                                    5.0 ul

10uM External Rvs Primer                0 ul                                    5.0 ul

Sterile milli-Q                             12.75 ul                                  7.75 ul 

Total                                              20.0 ul                                  25.0 ul

1.      Prepare DNA templates.  Assuming a relatively successful PCR for each of the two PCR products, I add around 1 ul of each template to a PCR tube.  If one PCR product was in lesser amount, I will compensate by adding another 1-2 ul of it.  Then add sterile milli-Q to achieve a total volume of 5 ul for each SOE reaction.  Set up a similar reaction but with the PCR products diluted ten-fold (for example add 45 ul of sterile milli-Q to a similar 5 ul of combined templates.

2.      Add 20 ul of Master Mix A to 5 ul volume of combined PCR templates and run these 25 ul reactions for the first 10 cycles (Maker a program called something like SOE PCR) in a PCR SOEing program. 

             SOE PCR (a typical program for a desired product less than 2 kb in size)

             1.  94^oC for 5 minutes.

             2.  94^oCfor 30 seconds

             3.  60^oC for 1.5 minutes

             4.  72^oC for 2.5 minutes

             5.  Repeat steps 2-4 ten times.

             6.  Hold at 10 ^oC for ten minutes (window of time to add mix B)

             7.  94 ^oC for 30 seconds

             8.  58 ^oC for 30 seconds

             9.  72 ^oC for 2 minutes

             10.  Repeat steps 7-9 thirty five times

             11.  Hold at 72 ^oC for 10 minutes

             12.  Hold at 10 ^oC indefinitely.

3.      After 10 cycles, add 25 ul of Master Mix B to the appropriate tubes.  Mix B includes the external primers that are needed to initiate the exponential increase of the SOE PCR product. 

4.      Run SOE PCRs on a preparative gel to isolate the product running at the expected size for the combination of the individual pieces.

Préparation de dNTP

voir le schéma ci dessous

Extraction d'ARN avec le Trizol

voir le protocole d'extraction du trizol cliquer ici

Description 

TRIzol® Reagent is a ready-to-use reagent, designed to isolate high quality total RNA (as well as DNA and proteins) from cell and tissue samples of human, animal, plant, yeast, or bacterial origin, within one hour. TRlzol® Reagent is a monophasic solution of phenol, guanidine isothiocyanate, and other proprietary components which facilitate the isolation of a variety of RNA spedes of large or small molecular size. TRIzol® Reagent maintains the integrity of the RNA due to higMy effective inhibition of RNase activity while disrupting cells and dissolving cell components during sample homogenization. TRIzol®Reagent allows for simultaneous processing of a large number of samples, and is an improvement to the single-step RNA isolation method developed by Chomcynski and Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 1987).

 TRIzol® Reagent allows the user to perform sequential précipitation of RNA, DNA, and proteins from a single sample (Chomczynski, 1993). After homogenizing the sample with TRIzol® Reagent, chloroform is added, and the homogenate is allowed to separate into a clear upper aqueous layer (containing RNA), an interphase, and a red lower organic layer (containing the DNA and proteins). RNA is precipitated from the aqueous layer with isopropanol. DNA is precipitated from the interphase/organic layer with ethanol. Protein is precipitated from the phenol-ethanol supernatant by isopropanol preipitation. The precipitated RNA, DNA, or protein is washed to remove impurities, and then resuspended for use in downstream applications.

• Isolated RNA can be used in RT-PCR, Northern Blot analysis. Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. 

• Isolated DNA can be used in PCR, Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. 

• Isolated protein can be used for Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation. 

RNA Isolation Procedure 

Always use the appropriate precautions to avoid RNase contamination when preparing and handling RNA. 

RNA précipitation 

l. (Optional) When precipitating RNA from small sample quantities (<=10^6 cells or <10 mg tissue), add 5-10 µg of RNase-free glycogen as a carrier to the aqueous phase. Note: Glycogen is co-precipitated with the RNA, but does not inhibit first-strand synthesis at concentrations <=4 mg/mL, and does not inhibit PCR. 

2. Add 0.5 mL of 100% isopropanol to the aqueous phase, per l m L of TRIzol® Reagent used for homogenization. 

 3. Incubate at room temperature for 10 minutes. 

 4. Centrifuge at 12/000 x g for 10 minutes at 4°C. Note: The RNA is often invisible prior to centrifugation, and forms a gel-like pellet on the side and bottom of the tube. 

5. Proceed to RNA wash.

RNA wash 

1. Remove the supenatant from the tube, leaving only the RNA pellet. 

2. Wash the pellet, with 1 mL of 75% ethanol per l mL of TRIzol® Reagent used in the initial homogenization. Note: The RNA can be stored in 75% ethanol at least l year at -20°C/ or at least 1 week at 4°C. 

3. Vortex the sample briefly, then centrifuge the tube at 7500 x g for 5 minutes at 4°C. Discard the wash. 

4. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5-10 minutes. Do not dry the pellet by vacuum centrifuge. Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility. Partially dissolved RNA samples have an A260/280 ratio <1.6. 

5. Proceed to RNA resuspension.

RNA resuspension 

l. Resuspend the RNA pellet in RNase-free water or 0.5% SOS solution (20-50 yL) by passing the solution up and down several times through a pipette tip. Note: Do not dissolve the RNA in 0.5% SDS if it is to be used in subsequent enzymatic reactions. 

2. Incubate in a water bath or heat block set at 55-60°C for 10-15 minutes. 

3. Proceed to downstream application, or store at -70°C

Principe PCR

Historique :

Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN. 

Principe :

La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle.
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. (1) Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin ;  (2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.

Pour réaliser une amplification sélective du fragment recherché, l’expérimentateur va  devoir optimiser les conditions expérimentales. Dans les chapitres suivants, vous trouverez quelques informations pour comprendre les critères et les limites dans le choix des différents paramètres. 

Les amorces :

Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Les oligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :

• des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température,
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
• des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).

Il est alors possible de faire synthétiser les deux oligonucléotides (d'une vingtaine de bases). La synthèse chimique d'ADN permet d'obtenir des oligonucléotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée (5'OH) contrairement aux ADN "dits" naturels. Ainsi, tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont déphosphorylés à leurs extrémités 5' 

Les températures :

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique :

• l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.
• l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces / matrice est réalisé.
• l’étape de polymérisation est à environ 72°C, température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées.

Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque nouvelle PCR. Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases des oligonucléotides amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation.
Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

(où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l’oligonucléotide). 

L’ADN matriciel :

En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante pour avoir une amplification, il faut cependant tenir compte de la probabilité de « rencontre » des molécules d’ADN matrice avec les amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Mais attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés dans les protocoles d’extraction d’ADN. 

L’ADN polymérase :

Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles. 

Le tampon :

Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg²⁺, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg²⁺ et de cations monovalents (K⁺ ou NH₄⁺) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.

Conditions expérimentales

En début d’expérience il y a un large excès d’oligonucléotides amorces ainsi que des dNTP en quantité suffisante pour synthétiser les copies d’ADN. La concentration en ADN est très faible. La difficulté en début d’expérience se situera essentiellement au niveau de la probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN matrice. Au fur et à mesure de l'avancée de la PCR, les copies d’ADN s’accumulent. Cette augmentation de la quantité d'ADN s'accompagne de modification du milieu réactionnel. La viscosité du milieu réactionnel augmente, les quantités d’oligonucléotides amorces et de dNTP diminuent. De plus, la synthèse d’ADN est accompagnée de la libération d’ions pyrophosphates qui en concentration élevée inhibent l’activité de la Taq polymérase. En fin d'expérience PCR, les conditions expérimentales auront changé jusqu'à devenir de plus en plus défavorables à une bonne activité enzymatique. On peut comprendre alors que le nombre de cycles lors d'une expérience PCR soit limité (généralement entre 30 et 40 cycles). 

Aspects quantitatifs de la réaction PCR :

Le nombre de cycle est défini par l’expérimentateur selon le degré d’amplification souhaité, dans la plupart des cas, ce nombre est d’environ 30. En théorie (et seulement en théorie!) il y a un facteur d’amplification de l’ordre de 2³⁰ soit un facteur d'un milliard. Nous avons vu dans le paragraphe précédent qu'en pratique les conditions expérimentales évoluent au fur et à mesure de l’avancée des cycles, le rendement de la réaction de polymérisation évolue de même, on peut espérer obtenir avec 30 à 40 cycles, un facteur d’amplification de l’ordre de 10⁵ à 10⁶.
L'animation suivante permet de suivre le nombre de copies synthétisée au cours d'une PCR de 30 cycles. La représentation graphique est réalisée avec une échelle semi-logarithmique. La quantité de copies "longues" d'ADN devient rapidement négligeable devant le nombre de copies d'ADN cible.

PCR Touchdown

PCR par essais (Touchdown PCR)

C’est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produit de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intêret devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais. 

RT PCR avec SuperScript 3

Introduction : 

Description SuperScript™ ID Reverse Transcriptase is an engineered version of M-MLV RT with reduced RNase H activity and mcreased thermal stability.

The enzyme is purified to near homogeneity from E. coli containing the modified pol gene of Moloney Murine Leukemia Virus (1,2). The enzyme can be used to synthesize first-strand cDNA at temperatures up to 55°C, providing increased specificity, higher yields of cDNA, and more full length product than other reverse transcriptases. It can generate cDNA from 100 bp to >12 kb.

First-Strand cDNA Synthesis :

The following 20 µl reaction volume can be used for 10 pg-5 pg of total RNA or 10pg-500ng of mRNA.

1. Add the following components to a nuclease-free microcentrifuge tube :
- l µl of oligo(dT)20 (50 pM); or 200-500 ng of oligo(dT)12-18, or 50-250 ng of random primers; or 2 pmol of gene-specific primer.
- 10 pg-5 µg total RNA or 10 pg-500 ng mRNA
- l µl 10 mM dNTP Mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH)
Stérile, distilled water to 13 µl

2. Heat mixture to 65°C for 5 minutes and incubate on ice for at least 1 minute

3. Collect the contents of the tube by brief centrifugation and add:
- 4 µL 5X First-Strand Buffer
- l µl 0.1 M DTT
- l µl RNaseOUT (Recombinant RNase Inhibitor. Note: When using less than 50 ng of starting RNA, the addition of RNaseOuT is essential.
- l µL of SuperScript 3 RT (200 units/µl) *If generating cDNA longer than 5 kb at temperatures above 50°C using a gene-specific primer or oligo(dT)20, the amount of SuperScript may be raised to 400 U (2 µl) to increase yield.

4. Mix by pipetting gently up and down. If using random primers, incubate tube at 25°C for 5 minutes.

5. Incubate at 50°C for 30-60 minutes. Increase the reaction temperature to 55°C for gene-spedfic primer. Reaction temperature may also be increased to 55°C for difficult templates or templates with high secondary structure.

6. Inactivate the reaction by heating at 70°C for 15 minutes.

The cDNA can now be used as a template for amplification in PCR. However, amplification of some PCR targets (those >1 kb) may require the removal of RNA complementary to the cDNA. To remove RNA complementary to the cDNA, add l µl (2 units) of E.coli RNase H and incubate at 37°C for 20 minutes.

Protocole ILLUMINA TRANSCRIPTOME

(12-Samples)

(Hybridation des lames, lavage/blocage/détection/lavage/centrifugation et lecture)

JOUR  1 (hybridation / incubation / préparation du tampon High Temp Buffer)
Temps de manipe : environ 20 minutes (démarrer vers l 6h)
Temps d'incubation : 16-20 heures

 MATERIEL
 HYB 10µl/échantillon (-20°C)
1 pipette multicanal 0.1-10^1
1 rack stérile
HCB 400µl/lame (-20°C)
 10X High-Temp Wash buffer 50ml (Température ambiante)
1 Eprouvette de 500ml en verre
RNase free water 500ml
Parafilm
1 feutre!!! Les lames!!!

- Préparer les ARNa : déposer dans la glace 750ng d'ARNa qsp 5µl d'eau RNase-free. Utiliser des barrettes RNase free 0.2µl de 8 échantillons, à bouchon unique, 1 barrette pour une lame.

- Descendre sur la plateforme ilIumina.
- Préchauffer le four à hybridation à 58°C.
 - Déposer les Tubes HYB et HCB dans le four à 58°C durant 10 minutes pour dissoudre les sels précipités. (Si au bout de 10 minutes il reste des sels, remettre les tubes dans le four durant 10 autres minutes). Mélanger les tubes avant utilisation. '

- Ajouter 10µl de HYB à chaque ARNa avec la pipette multicanal après avoir déposé 500µl de HYB (pour 4 lames) dans un rack stérile à usage unique.
- Mélanger et centrifuger brièvement les échantillons.
- Fragmenter les échantillons 5 minutes à 65°C (thermocycleur BioRad, Cliquer sur RUN puis sélectionner le programme GEX65).
- Centrifuger brièvement les échantillons.

- Préparer la chambre à hybridation (Hyb chamber + Hyb Chamber gasket).
 - Déposer 200µl de HCB dans les réservoirs de la chambre à hybridation.
- Pour éviter l’évaporation du tampon HCB, fermer la chambre d'hybridation avec son couvercle le temps de procéder à hybridation.

 - Retirer les lames de leurs emballages (manipuler les lames du coté du code barre, avec des gants sans poudre ou à la pince).
 - Déposer les lames dans les Hyb Chamber Inserts dans le sens du code barre.
- Déposer les  15µl de l'échantillon. (Noter l'ordre des positions des 8 échantillons).
- Placer les lames + Hyb Chamber Inserts dans la Chambre à Hybridation.
- Fermer le couvercle de la chambre à hybridation (Attention de bien appuyer sur le couvercle en fermant les charnières)
-Incuber 16-20 h à 58°C dans le four à hybridation sous agitation (position 5).
- Préparer le 1X High-Temp Wash buffer en ajoutant 50ml du stock 10X dans 450 ml de RNase Free water)
- Placer le tampon dans le bloc chauffant à 55°C, fermer le bloc chauffant et laisser incuber toute la nuit.

JOUR 2 (lavage/blocage, détection/lavage/centrifugation)
Temps de manipe : environ 65 minutes (démarrer vers 10h)

MATERIEL
10X High-Temp Wash buffer 500ml (55°C, préparé la veille et incubé toute la nuit)
Block E1 buffer 6ml/lame (4°C)
 1 Falcon de 15ml
Wash E1BC 2L (Température ambiante)
 1 Bouteille de 2L
RNase free water 2 L
Strepatvidin-Cy3 2µl à 1 mg/ml par puce (-20°C)
Ethanol 100% 250ml (Température ambiante)
Pipette Boy!!
1 Feutre !!!

- Allumer le scanner en arrivant.

- Ajouter 6ml de E1BC buffer (=WBC) dans 2L d'eau RNase-free.

- Déposer dans le tube Falcon 2ml de Block E1buffer + 2µl de streptavidin-Cy3 à 1mg/ml (Si plusieurs lames, préparer dans le même tube). Placer le tube dans le noir jusqu'à utilisation.

- Mettre environ 750ml d’E1BC buffer dilué dans le cristallisoir.
- Retirer la chambre d'hybridation du four.
- Prendre la 1ere lame et la placer dans les 750ml de E1BC buffer dilué.
- Retirer le film de la lame en restant immergé.
- Placer la lame dans le portoir à lame (spotting vers l’extérieur) immergé dans 250ml d’E1BC buffer dilué.
- Procéder de la même façon pour toutes les lames.

- Plonger ensuite le portoir dans le block chauffant contenant le High-Temp buffer à 55°C, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 10 minutes avec le couvercle fermé.

- Durant l'incubation mettre 250 ml d’E1BC buffer dilué dans un plat transparent propre.
- Après les 10 minutes d'incubation, transférer immédiatement le portoir à lame dans les 250ml d’E1BC buffer dilué. Faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber  5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).
- Transférer le portoir à lame dans un plat transparent contenant 250ml d'E1BC, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 2 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer les lames dans les portoirs en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 4ml de E1 Block buffer et les déposer sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Placer les lames dans un nouveau portoir en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 2ml de E1 Block buffer + Strepatvidin-cy3 et déposer les sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer 250ml de E1BC buffer dilué dans un plat propre.
- Déposer les lames dans le portoir à lame et immerger le portoir dans le tampon E1BC buffer dilué, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Préparer la centrifugeuse : mettre du papier absorbant sur les plots qui vont être utilisés pour centrifuger les lames
- Déposer rapidement les lames dans deux portoirs à lame propres et centrifuger à 275g durant 4 minutes à 25°C.
- Scanner les lames

SCAN
- Allumer le scan au moins 30 min avant de scanner les lames.
- Mettre le CD correspondant à la lame dans l'ordinateur.
- Copier le dossier decode data de chaque CD dans my document/P3S’s Document/illumina/TiphaineTranscriptome/decode data.
- Dans le dossier TiphaineTranscriptome/sample sheet, créer une feuille de route Excel en.csv avec la position des échantillons sur la lame, le numéro de la lame, la date du scan...
- Ouvrir BeadStudio et vérifier sur la page d'accueil du site Illumina qu'il n'y a pas une nouvelle version du manifest de la lame HumanRef-8v2.
- Lancer le logiciel BeadScan.

Généralités sur le Nanodrop et le bioanalyseur

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Protocole Amplification Ambion illumina

Quantité d’ARNt recommandé pour l’amplification (50-500 ng) le mieux c’est 200 ng

1. Synthèse du premier brin d’ADNc :

Dans la glace

Déposer un volume maximal de 5,5µl d’ARN totaux dans un microtube 0,2ml stérile Rnase-Free.
Ajouter de l’eau nucléase free pour compléter à 5,5µl si nécessaire.

Décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légèrement si nécessaire.

A température ambiante assembler dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 oligo (dT) Primer	0.5	3.2
10X First Strand Buffer	1	6.3
dNTP Mix	2	12.6
Rnase Inhibitor	0.5	3.2
ArrayScript	0.5	3.2
Total (µl)	4.5	28.5

Use 4,5µl of Reverse Transcription Master Mix per reaction.

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 4,5µl de Mix dans chaque tube (Vf=10µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h à 42°C (thermocycleur + couvercle chauffant non fermé)
⇒ Glace

2. Synthèse du second brin d’ADNc :

10 minutes avant la fin du programme PCR (2h à 42°C), décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légerement si nécessaire.

Dans la glace ajouter dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
Nuclease Free Water	31.5	198.5
10X Second Strand Buffer	5	31.5
dNTP Mix	2	12.6
DNA Polymérase	1	6.3
Rnase H	0.5	3.2
Total (µl)	40	252.1

Use 40µl of second Strand Master Mix per reaction

Mélanger le MIX en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 40µl de Mix dans chaque tube (Vf = 50µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brievement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h 16°C (thermocycleur sans couvercle chauffant).
⇒ Glace (l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

3. Purification de l’ADNc :

Apres purification, on peut mettre à -20°C
Speed Vacquer les échantillons 1h15 min pour les sécher complètement.

Une fois speed vacquer :
- Ajouter 8,75 µl d’eau Nucléase Free à 50°C au culot SpeedVacqué ( l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

4. Transcription in vitro :

A tempétature ambiante ajouter dans l’ordre suivant dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 10X Reaction Buffer	1.25	8
T7 Enzyme Mix	1.25	8
Biotin-16-UTP	1.25	8
Total (µl)	40	24

Use 3,75 µl of IVT Master Mix per reaction

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 3,75µl de Mix dans chaque tube (Vf = 12,5µl)
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube

⇒ 4H - 14h à 37°C
⇒ Stopper la réaction avec 87,5µl d’eau nucléase free. (Vf=100µl)

5. Purification des ARNa :

⇒ Nanodrop