Préparation de dNTP

voir le schéma ci dessous

Extraction d'ARN avec le Trizol

voir le protocole d'extraction du trizol cliquer ici

Description 

TRIzol® Reagent is a ready-to-use reagent, designed to isolate high quality total RNA (as well as DNA and proteins) from cell and tissue samples of human, animal, plant, yeast, or bacterial origin, within one hour. TRlzol® Reagent is a monophasic solution of phenol, guanidine isothiocyanate, and other proprietary components which facilitate the isolation of a variety of RNA spedes of large or small molecular size. TRIzol® Reagent maintains the integrity of the RNA due to higMy effective inhibition of RNase activity while disrupting cells and dissolving cell components during sample homogenization. TRIzol®Reagent allows for simultaneous processing of a large number of samples, and is an improvement to the single-step RNA isolation method developed by Chomcynski and Sacchi (Chomczynski & Sacchi, 1987).

 TRIzol® Reagent allows the user to perform sequential précipitation of RNA, DNA, and proteins from a single sample (Chomczynski, 1993). After homogenizing the sample with TRIzol® Reagent, chloroform is added, and the homogenate is allowed to separate into a clear upper aqueous layer (containing RNA), an interphase, and a red lower organic layer (containing the DNA and proteins). RNA is precipitated from the aqueous layer with isopropanol. DNA is precipitated from the interphase/organic layer with ethanol. Protein is precipitated from the phenol-ethanol supernatant by isopropanol preipitation. The precipitated RNA, DNA, or protein is washed to remove impurities, and then resuspended for use in downstream applications.

• Isolated RNA can be used in RT-PCR, Northern Blot analysis. Dot Blot hybridization, poly(A)+ selection, in vitro translation, RNase protection assay, and molecular cloning. 

• Isolated DNA can be used in PCR, Restriction Enzyme digestion, and Southern Blots. 

• Isolated protein can be used for Western Blots, recovery of some enzymatic activity, and some immunoprecipitation. 

RNA Isolation Procedure 

Always use the appropriate precautions to avoid RNase contamination when preparing and handling RNA. 

RNA précipitation 

l. (Optional) When precipitating RNA from small sample quantities (<=10^6 cells or <10 mg tissue), add 5-10 µg of RNase-free glycogen as a carrier to the aqueous phase. Note: Glycogen is co-precipitated with the RNA, but does not inhibit first-strand synthesis at concentrations <=4 mg/mL, and does not inhibit PCR. 

2. Add 0.5 mL of 100% isopropanol to the aqueous phase, per l m L of TRIzol® Reagent used for homogenization. 

 3. Incubate at room temperature for 10 minutes. 

 4. Centrifuge at 12/000 x g for 10 minutes at 4°C. Note: The RNA is often invisible prior to centrifugation, and forms a gel-like pellet on the side and bottom of the tube. 

5. Proceed to RNA wash.

RNA wash 

1. Remove the supenatant from the tube, leaving only the RNA pellet. 

2. Wash the pellet, with 1 mL of 75% ethanol per l mL of TRIzol® Reagent used in the initial homogenization. Note: The RNA can be stored in 75% ethanol at least l year at -20°C/ or at least 1 week at 4°C. 

3. Vortex the sample briefly, then centrifuge the tube at 7500 x g for 5 minutes at 4°C. Discard the wash. 

4. Vacuum or air dry the RNA pellet for 5-10 minutes. Do not dry the pellet by vacuum centrifuge. Note: Do not allow the RNA to dry completely, because the pellet can lose solubility. Partially dissolved RNA samples have an A260/280 ratio <1.6. 

5. Proceed to RNA resuspension.

RNA resuspension 

l. Resuspend the RNA pellet in RNase-free water or 0.5% SOS solution (20-50 yL) by passing the solution up and down several times through a pipette tip. Note: Do not dissolve the RNA in 0.5% SDS if it is to be used in subsequent enzymatic reactions. 

2. Incubate in a water bath or heat block set at 55-60°C for 10-15 minutes. 

3. Proceed to downstream application, or store at -70°C

Principe PCR

Historique :

Cette méthode de Biologie Moléculaire a été mise au point en 1985 par Kary Mullis, qui obtint pour ces travaux le prix Nobel de Chimie en 1993. Aujourd’hui, ce procédé révolutionnaire couplé à l’utilisation d’une ADN polymerase thermorésistante permet d’obtenir, sans clonage, une amplification considérable d’un fragment donné d’ADN. 

Principe :

La réaction PCR (Polymerase Chain Reaction) permet d'amplifier in vitro une région spécifique d'un acide nucléique donné afin d'en obtenir une quantité suffisante pour le détecter et l’étudier.
Pour se faire, une série de réactions permettant la réplication d’une matrice d’ADN double brin est répétée en boucle. Ainsi, au cours de la réaction PCR, les produits obtenus à la fin de chaque cycle servent de matrice pour le cycle suivant, l’amplification est donc exponentielle.
Pour avoir réplication d’un ADN double brin, il faut agir en trois étapes. (1) Il faut dénaturer l’ADN pour obtenir des matrices simple brin ;  (2) borner et amorcer la réplication de la séquence à amplifier à l’aide d’oligonucléotides amorces spécifiques ; (3) réaliser la réaction de polymérisation du brin complémentaire. A la fin de chaque cycle, les produits sont sous forme d'ADN double brin.

Pour réaliser une amplification sélective du fragment recherché, l’expérimentateur va  devoir optimiser les conditions expérimentales. Dans les chapitres suivants, vous trouverez quelques informations pour comprendre les critères et les limites dans le choix des différents paramètres. 

Les amorces :

Dans la mise au point de la réaction PCR, le choix des amorces est crucial. Elles vont avoir un double rôle : en s'hybridant à l'ADN matrice, elles délimitent la région d’ADN à amplifier (étape 2 du cycle) et avec leur extrémité 3' OH libre servir d’amorce pour l’ADN polymérase (étape 3 du cycle).
Les oligonucléotides amorces s’hybrident aux extrémités de la séquence qui va être amplifiée, il faut donc connaître les séquences nucléotidiques des extrémités de la région ADN amplifiée. C'est en effet au niveau de ces extrémités que les oligonucléotides amorces vont s'hybrider. Pour faciliter le choix des séquences des deux amorces, des logiciels d’analyse de séquences permettent de vérifier les points suivants :

• des Tm comparables. Les oligonucléotides amorces doivent s’hybrider à l'ADN matrice dans les mêmes conditions de température,
• des séquences qui ne soient pas complémentaires entre elles (en particulier dans la région 3’),
• des séquences qui ne contiennent pas de séquences répétées inversées (pas de repliement intramoléculaire).

Il est alors possible de faire synthétiser les deux oligonucléotides (d'une vingtaine de bases). La synthèse chimique d'ADN permet d'obtenir des oligonucléotides dont l'extrémité 5' n'est pas phosphorylée (5'OH) contrairement aux ADN "dits" naturels. Ainsi, tous les fragments d'ADN amplifiés par PCR sont déphosphorylés à leurs extrémités 5' 

Les températures :

Les trois étapes, constituant un cycle de PCR, sont effectuées à des températures différentes permettant de contrôler l’activité enzymatique :

• l’étape de dénaturation, est réalisée à environ 95°C, pour une dissociation complète des deux brins d’ADN.
• l’étape d’hybridation se fait à une température qui sera définie selon la nature des amorces (cette température varie de 50 à 60°C). Cette température va déterminer la stabilité des hybrides une fois que l’appariement amorces / matrice est réalisé.
• l’étape de polymérisation est à environ 72°C, température de « travail » de l’ADN polymérase thermorésistante utilisée. Au cours de cette étape, les brins complémentaires d’ADN sont synthétisés à partir des extrémités 3’OH libre des amorces hybridées.

Les températures de dénaturation et de polymérisation sont fixes, seule la température d’hybridation devra être calculée pour chaque nouvelle PCR. Cette température d’hybridation dépend de la composition en bases des oligonucléotides amorces. Elle est légèrement inférieure (environ de 5°C) au Tm qui est la température de demi-dénaturation.
Pour calculer le Tm d’un oligonucléotide inférieur à 30 nucléotides, on utilise la relation suivante :

Tm = 2 (A + T) + 4 (G + C)

(où A, T, G et C sont respectivement le nombre de chacune de ces bases dans l’oligonucléotide). 

L’ADN matriciel :

En théorie une copie ADN de la séquence recherchée est suffisante pour avoir une amplification, il faut cependant tenir compte de la probabilité de « rencontre » des molécules d’ADN matrice avec les amorces. Dans la pratique plusieurs copies sont nécessaires pour avoir un résultat correct. Mais attention, la mauvaise qualité et/ou une quantité trop importante d’ADN matrice peut conduire à une amplification aspécifique, voire à une inhibition enzymatique. Il est possible d’expliquer cette inhibition par la présence de contaminants provenant de l’échantillon ou des réactifs utilisés dans les protocoles d’extraction d’ADN. 

L’ADN polymérase :

Les premières ADN polymérases utilisées provenaient d'une bactérie thermophile (résistante à des températures très élevées), comme par exemple Thermus aquaticus (Taq polymérase). De nos jours, les enzymes utilisées sont dites recombinantes, ce qui simplifie considérablement leur obtention, et leurs propriétés ont été largement modifiées pour les rendre plus efficaces et plus fidèles. 

Le tampon :

Le tampon utilisé pour la réaction PCR sert à maintenir stable le pH du milieu réactionnel au niveau optimal pour la Taq polymérase (TrisHCl à pH basique 8,5 à 9). Il contient des cations bivalents Mg²⁺, cofacteurs indispensables pour la réaction de polymérisation avec la Taq polymérase. La présence dans le milieu réactionnel des cations bivalents Mg²⁺ et de cations monovalents (K⁺ ou NH₄⁺) vont neutraliser les charges négatives des groupements phosphates au niveau de l’ADN et ainsi stabiliser les hybrides ADN/ADN. En pratique, la concentration en sel doit cependant rester compatible avec l’activité de l’ADN polymérase.

Conditions expérimentales

En début d’expérience il y a un large excès d’oligonucléotides amorces ainsi que des dNTP en quantité suffisante pour synthétiser les copies d’ADN. La concentration en ADN est très faible. La difficulté en début d’expérience se situera essentiellement au niveau de la probabilité de rencontre des amorces avec l’ADN matrice. Au fur et à mesure de l'avancée de la PCR, les copies d’ADN s’accumulent. Cette augmentation de la quantité d'ADN s'accompagne de modification du milieu réactionnel. La viscosité du milieu réactionnel augmente, les quantités d’oligonucléotides amorces et de dNTP diminuent. De plus, la synthèse d’ADN est accompagnée de la libération d’ions pyrophosphates qui en concentration élevée inhibent l’activité de la Taq polymérase. En fin d'expérience PCR, les conditions expérimentales auront changé jusqu'à devenir de plus en plus défavorables à une bonne activité enzymatique. On peut comprendre alors que le nombre de cycles lors d'une expérience PCR soit limité (généralement entre 30 et 40 cycles). 

Aspects quantitatifs de la réaction PCR :

Le nombre de cycle est défini par l’expérimentateur selon le degré d’amplification souhaité, dans la plupart des cas, ce nombre est d’environ 30. En théorie (et seulement en théorie!) il y a un facteur d’amplification de l’ordre de 2³⁰ soit un facteur d'un milliard. Nous avons vu dans le paragraphe précédent qu'en pratique les conditions expérimentales évoluent au fur et à mesure de l’avancée des cycles, le rendement de la réaction de polymérisation évolue de même, on peut espérer obtenir avec 30 à 40 cycles, un facteur d’amplification de l’ordre de 10⁵ à 10⁶.
L'animation suivante permet de suivre le nombre de copies synthétisée au cours d'une PCR de 30 cycles. La représentation graphique est réalisée avec une échelle semi-logarithmique. La quantité de copies "longues" d'ADN devient rapidement négligeable devant le nombre de copies d'ADN cible.

PCR Touchdown

PCR par essais (Touchdown PCR)

C’est un protocole utilisé pour amplifier de l'ADN faiblement représenté et/ou subissant une compétition sur leurs amorces par des produit de pseudo-gène. Il consiste à avoir une température d’hybridation très haute lors des premiers cycles afin d’assurer une forte stringence et donc une amplification spécifique. Une fois que la séquence d'intêret devient majoritaire vis-à-vis de ses compétiteurs, la température d’hybridation est progressivement abaissée afin d’assurer une meilleure efficacité de PCR. L’efficacité n’étant pas constante tout au long de la réaction, il est très difficile (impossible ?) de pouvoir obtenir un résultat quantitatif sans biais. 

RT PCR avec SuperScript 3

Introduction : 

Description SuperScript™ ID Reverse Transcriptase is an engineered version of M-MLV RT with reduced RNase H activity and mcreased thermal stability.

The enzyme is purified to near homogeneity from E. coli containing the modified pol gene of Moloney Murine Leukemia Virus (1,2). The enzyme can be used to synthesize first-strand cDNA at temperatures up to 55°C, providing increased specificity, higher yields of cDNA, and more full length product than other reverse transcriptases. It can generate cDNA from 100 bp to >12 kb.

First-Strand cDNA Synthesis :

The following 20 µl reaction volume can be used for 10 pg-5 pg of total RNA or 10pg-500ng of mRNA.

1. Add the following components to a nuclease-free microcentrifuge tube :
- l µl of oligo(dT)20 (50 pM); or 200-500 ng of oligo(dT)12-18, or 50-250 ng of random primers; or 2 pmol of gene-specific primer.
- 10 pg-5 µg total RNA or 10 pg-500 ng mRNA
- l µl 10 mM dNTP Mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH)
Stérile, distilled water to 13 µl

2. Heat mixture to 65°C for 5 minutes and incubate on ice for at least 1 minute

3. Collect the contents of the tube by brief centrifugation and add:
- 4 µL 5X First-Strand Buffer
- l µl 0.1 M DTT
- l µl RNaseOUT (Recombinant RNase Inhibitor. Note: When using less than 50 ng of starting RNA, the addition of RNaseOuT is essential.
- l µL of SuperScript 3 RT (200 units/µl) *If generating cDNA longer than 5 kb at temperatures above 50°C using a gene-specific primer or oligo(dT)20, the amount of SuperScript may be raised to 400 U (2 µl) to increase yield.

4. Mix by pipetting gently up and down. If using random primers, incubate tube at 25°C for 5 minutes.

5. Incubate at 50°C for 30-60 minutes. Increase the reaction temperature to 55°C for gene-spedfic primer. Reaction temperature may also be increased to 55°C for difficult templates or templates with high secondary structure.

6. Inactivate the reaction by heating at 70°C for 15 minutes.

The cDNA can now be used as a template for amplification in PCR. However, amplification of some PCR targets (those >1 kb) may require the removal of RNA complementary to the cDNA. To remove RNA complementary to the cDNA, add l µl (2 units) of E.coli RNase H and incubate at 37°C for 20 minutes.

Protocole ILLUMINA TRANSCRIPTOME

(12-Samples)

(Hybridation des lames, lavage/blocage/détection/lavage/centrifugation et lecture)

JOUR  1 (hybridation / incubation / préparation du tampon High Temp Buffer)
Temps de manipe : environ 20 minutes (démarrer vers l 6h)
Temps d'incubation : 16-20 heures

 MATERIEL
 HYB 10µl/échantillon (-20°C)
1 pipette multicanal 0.1-10^1
1 rack stérile
HCB 400µl/lame (-20°C)
 10X High-Temp Wash buffer 50ml (Température ambiante)
1 Eprouvette de 500ml en verre
RNase free water 500ml
Parafilm
1 feutre!!! Les lames!!!

- Préparer les ARNa : déposer dans la glace 750ng d'ARNa qsp 5µl d'eau RNase-free. Utiliser des barrettes RNase free 0.2µl de 8 échantillons, à bouchon unique, 1 barrette pour une lame.

- Descendre sur la plateforme ilIumina.
- Préchauffer le four à hybridation à 58°C.
 - Déposer les Tubes HYB et HCB dans le four à 58°C durant 10 minutes pour dissoudre les sels précipités. (Si au bout de 10 minutes il reste des sels, remettre les tubes dans le four durant 10 autres minutes). Mélanger les tubes avant utilisation. '

- Ajouter 10µl de HYB à chaque ARNa avec la pipette multicanal après avoir déposé 500µl de HYB (pour 4 lames) dans un rack stérile à usage unique.
- Mélanger et centrifuger brièvement les échantillons.
- Fragmenter les échantillons 5 minutes à 65°C (thermocycleur BioRad, Cliquer sur RUN puis sélectionner le programme GEX65).
- Centrifuger brièvement les échantillons.

- Préparer la chambre à hybridation (Hyb chamber + Hyb Chamber gasket).
 - Déposer 200µl de HCB dans les réservoirs de la chambre à hybridation.
- Pour éviter l’évaporation du tampon HCB, fermer la chambre d'hybridation avec son couvercle le temps de procéder à hybridation.

 - Retirer les lames de leurs emballages (manipuler les lames du coté du code barre, avec des gants sans poudre ou à la pince).
 - Déposer les lames dans les Hyb Chamber Inserts dans le sens du code barre.
- Déposer les  15µl de l'échantillon. (Noter l'ordre des positions des 8 échantillons).
- Placer les lames + Hyb Chamber Inserts dans la Chambre à Hybridation.
- Fermer le couvercle de la chambre à hybridation (Attention de bien appuyer sur le couvercle en fermant les charnières)
-Incuber 16-20 h à 58°C dans le four à hybridation sous agitation (position 5).
- Préparer le 1X High-Temp Wash buffer en ajoutant 50ml du stock 10X dans 450 ml de RNase Free water)
- Placer le tampon dans le bloc chauffant à 55°C, fermer le bloc chauffant et laisser incuber toute la nuit.

JOUR 2 (lavage/blocage, détection/lavage/centrifugation)
Temps de manipe : environ 65 minutes (démarrer vers 10h)

MATERIEL
10X High-Temp Wash buffer 500ml (55°C, préparé la veille et incubé toute la nuit)
Block E1 buffer 6ml/lame (4°C)
 1 Falcon de 15ml
Wash E1BC 2L (Température ambiante)
 1 Bouteille de 2L
RNase free water 2 L
Strepatvidin-Cy3 2µl à 1 mg/ml par puce (-20°C)
Ethanol 100% 250ml (Température ambiante)
Pipette Boy!!
1 Feutre !!!

- Allumer le scanner en arrivant.

- Ajouter 6ml de E1BC buffer (=WBC) dans 2L d'eau RNase-free.

- Déposer dans le tube Falcon 2ml de Block E1buffer + 2µl de streptavidin-Cy3 à 1mg/ml (Si plusieurs lames, préparer dans le même tube). Placer le tube dans le noir jusqu'à utilisation.

- Mettre environ 750ml d’E1BC buffer dilué dans le cristallisoir.
- Retirer la chambre d'hybridation du four.
- Prendre la 1ere lame et la placer dans les 750ml de E1BC buffer dilué.
- Retirer le film de la lame en restant immergé.
- Placer la lame dans le portoir à lame (spotting vers l’extérieur) immergé dans 250ml d’E1BC buffer dilué.
- Procéder de la même façon pour toutes les lames.

- Plonger ensuite le portoir dans le block chauffant contenant le High-Temp buffer à 55°C, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 10 minutes avec le couvercle fermé.

- Durant l'incubation mettre 250 ml d’E1BC buffer dilué dans un plat transparent propre.
- Après les 10 minutes d'incubation, transférer immédiatement le portoir à lame dans les 250ml d’E1BC buffer dilué. Faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber  5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).
- Transférer le portoir à lame dans un plat transparent contenant 250ml d'E1BC, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 2 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer les lames dans les portoirs en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 4ml de E1 Block buffer et les déposer sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Placer les lames dans un nouveau portoir en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 2ml de E1 Block buffer + Strepatvidin-cy3 et déposer les sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer 250ml de E1BC buffer dilué dans un plat propre.
- Déposer les lames dans le portoir à lame et immerger le portoir dans le tampon E1BC buffer dilué, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Préparer la centrifugeuse : mettre du papier absorbant sur les plots qui vont être utilisés pour centrifuger les lames
- Déposer rapidement les lames dans deux portoirs à lame propres et centrifuger à 275g durant 4 minutes à 25°C.
- Scanner les lames

SCAN
- Allumer le scan au moins 30 min avant de scanner les lames.
- Mettre le CD correspondant à la lame dans l'ordinateur.
- Copier le dossier decode data de chaque CD dans my document/P3S’s Document/illumina/TiphaineTranscriptome/decode data.
- Dans le dossier TiphaineTranscriptome/sample sheet, créer une feuille de route Excel en.csv avec la position des échantillons sur la lame, le numéro de la lame, la date du scan...
- Ouvrir BeadStudio et vérifier sur la page d'accueil du site Illumina qu'il n'y a pas une nouvelle version du manifest de la lame HumanRef-8v2.
- Lancer le logiciel BeadScan.

Généralités sur le Nanodrop et le bioanalyseur

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