Protease Inhibitor Panel

Protocole Purification de protéines avec un Tag GST.

Tampons :

Resuspension / binding buffer :                                              lysis buffer :                                      Cleavage buffer :

- 50 mM Tris pH7.5                                                         - 50 mM Tris pH7.5                         - 50 mM Tris pH7

- 500mM NaCl                                                                 - 500 mM NaCl                                 - 150 mM NaCl

- 1mM DTT                                                                        - 1% triton X100                               - 1mM DTT

                                                                                              - 1 mM DTT                                        - 1 mM EDTA

                                                                                              - 1 mM PMSF

                                                                                              - 5 mM Benzamidine

Production :

1.       Faire une préculture de 60ml ( compter 10ml de 2YT par erlen de 1L )

2.       Le lendemain, inoculer les cultures avec 10ml et faire pousser à 37°C jusqu’à DO 0.6

3.       Faire descendre la température des erlens à 16°C en les mettant dans la glace, environ 1h

4.       Induire avec de l’IPTG 0.5M, concentration finale 0.5mM IPTG

5.       Faire pousser O/N à 37°C:

6.       Centrifuger 1L de culture dans les grands pots à 5000g pendant 10min, en utilisant le rotor adapté.

7.       Resuspendre avec 100 ml de buffer resuspension

8.       Pooler la solution bactérienne concentrée dans un tube de 500 ml

9.       Centrifuger à 4°C 10 min à 5000g

10.   Eliminer le surnageant

11.   Congeler dans l’azote liquide

Purification :

1.       Incuber 5 ml de billes GSH sepharose pendant 20 min à 4°C avec 50 ml de lysis buffer

2.       Resuspendre le culot dans 100 ml de lysis buffer ( garder 2 µl pour un gel SDS, Extrait brute )

3.       Incuber avec un barreau aimanté pour homogénéiser la solution bactérienne concentrée.

4.       Soniquer 6 X 30 sec avec 30s – 1 min de pause entre chaque cycle ( maintenir la solution à froid )

5.       Clarifier le lysat en centrifugeant 30 min à 15000g ( rotor JA-17)

6.       Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, S = soluble

7.       Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, I = insoluble

8.       Répartir les billes incubées avec le tampon de lyse dans des tubes corning en fonction du volume de lysat clarifié.

9.       Incuber 2 h à 4°C sur une roue.

10.   Centrifuger le(s) tubes corning 10 min à 5000g 4°C

11.   Eliminer le surnageant ( garder 2 µl pour un gel SDS, NL = non lié avant coupure )

12.   Prendre 2 µl de billes pour un gel SDS, L = lié avant coupure

13.   Resuspendre les billes dans le tampon de binding en poolant dans 1 tube corning de 50 ml

14.   Laver 3 X avec du tampon de binding en centrifugeant 7min 5000g à 4°C

15.   Transférer les billes dans un tube de 15 ml

16.   Laver 3 X avec du tampon de clivage en centrifugeant 7min 5000g à 4°C

17.   Reprendre les billes dans 1V de billes avec le tampon de clivage

18.   Ajouter 160 µl de Precission

19.   Incuber O/N à 4°C sur une roue

20.   Centrifuger 10 min à 5000g 4°C

21.   Prendre 2 µl de billes pour un gel SDS, L = lié après coupure

22.   Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, NL = non lié après coupure = Protéine purifiée

système pET

Fonctionnement du système pET avec la casette DE3 et le pLysS
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Expression de proteine dans le periplasme bactérien

Pré séquence Dsb :
atg aag aaa atc tgg ctg gcc ctg gca ggc ctg gtt ctg gct ttc agc gct tcc gct

Site Nde1 :
CATATG

Site Eco R1 :
GAATTC

Site Not 1 :
GCGGCCGC

Séquence 8F1 N497Q & R503K

CATATG atg aag aaa atc tgg ctg gcc ctg gca ggc ctg gtt ctg gct ttc agc gct tcc gct GAATTC gat cag tgc att gtt gat gac atc act tac aat gtg cag gac aca ttc cac aag aag cat gaa gag ggg cac atg ctg aac tgt aca tgc ttc ggt cag ggt cgg ggc aag tgg aag tgt gat ccc gtc CACCACCATCATCACCATCAT CAC CAT CAC CAT CAC TGA GCGGCCGC

Séquence 9F1

CATATG atg aag aaa atc tgg ctg gcc ctg gca ggc ctg gtt ctg gct ttc agc gct tcc gct GAATTC gac caa tgc cag gat tca gag act ggg acg ttt tat caa att gga gat tca tgg gag aag tat gtg cat ggt gtc aga tac cag tgc tac tgc tat ggc cgt ggc att ggg gag tgg cat tgc caa cct tta cag acc tat cca agc tca CACCACCATCATCACCATCAT CAC CAT CAC CAT CAC TGA GCGGCCGC

Periplasmic localization

An alternative strategy to obtain active, soluble proteins is to use vectors that enable export into the periplasm, which is a more favorable environment for folding and disulfide bond formation (Rietsch et al., 1996; Raina and Missiakas, 1997; Sone et al., 1997). For this purpose vectors carrying signal peptides are used, such as pET-12, 20, 22, 25, 26, 27, 36, 37, 38, 39 and 40. Target proteins exported to the periplasm with the CBDcenA signal sequence may leak to the medium for simplified purification (Novy et al., 1997). However, some target proteins will not be good candidates for periplasmic localization. For example, some fusions of b -gal to a periplasmic protein have proven to be toxic (Snyder and Silhavy, 1995). In addition, the net charge of the Nterminal amino acids on the mature protein can inhibit translocation (Kajava et al., 2000) While several pET vectors contain signal sequences for fusion with target genes, pET-39b(+) and pET-40b(+) are designed to create fusions to the enzymes that catalyze the formation (DsbA) or isomerization (DsbC) of disulfide bonds in the periplasm (Missiakas et al., 1994; Zapun et al.,1995). If a fusion protein is competent to localize to the periplasm, then its direct association with the catalytic enzyme may enhance its solubility and facilitate disulfide bond formation. A properly folded fusion protein requiring formation of disulfide bonds for activity has been isolated following fusion to DsbA (Collins-Racie et al., 1995). Note that over-expressed, purified DsbC enzyme is isolated in the oxidized state and requires exposure to a reducing agent (0.1 to 1.0 mM DTT) to acquire disulfide isomerase activity in vitro (Joly and Swartz, 1997). Typically, a DsbC fusion protein expressed from pET-40b(+) is first purified by His•Bind® or Ni-NTA His•Bind chromatography. Prior to exposing the fusion protein to a reducing agent, either EDTA should be added to a final concentration of 1 mM, or the sample should be dialyzed to remove residual Ni2+. EDTA and dialysis is probably unnecessary if Ni-NTA His•Bind resin was used for purification.

Réaction controle de la réaction de ligation T4 DNA ligase

Procédure tri plasmocytes sur robot MACS miltenyi biotec

Avant chaque tri Préparer 2 bouteilles de 1litre de Running buffer stérile. PBS 1X pH 7.2 0,5 % BSA 2 mM EDTA stocker à + 4°C.

Préparer 1 litre d’ethanol 70% stérile.

Marquage plasmocytes :  vérifier la présence de plasmocytes CD19low CD27bright /CD19 au FACS. Si plasmocytes >5% procéder au tri.

Mesurer le volume final de sang total (réception des échantillons sur tube ACD-A)

Ajouter 50µl de Whole Blood CD138 MicroBeads (ref 130-093-062) par ml de sang total.
Homogéneiser par retournement et incuber 15 min a +4°C Laver avec 2 à 5 ml de Running buffer par ml de sang total ( aliquoter en conséquence). Puis centrifuger 10 min à 445g (environ 1500t) sans le FREIN Aspirer le surnageant en laissant 2 mm de buffer et sans aspirer de cellule en surface. Resuspendre de culot en ajoutant un volume de buffer pour un volume du culot  (ex si culot de 5 ml ajouter 5 ml de buffer) Attention : ne pas dépasser un volume final de 13ml car le robot procède a une dilution 1/3 dans l’automate qui stoppe le tri s’il ne peut faire cette dilution.

Procéder au tri sur automate. Matériel nécessaire : Running buffer   environ   2 litres / 50ml de sang total à trier
Ethanol 70%  Tubes de 50 ml pour recueillir la fraction négative et tube de 15ml pour recueillir les plasmocytes triés. Colonnes de tri  Gants.

En arrivant au robot, il faut vérifier que les bouteilles soient pleines et la poubelle du robot soit vide. Sinon : Remplir la bouteille de Wash solution (bouteille arrière à droite) si nécessaire. La Wash solution est déjà sur site (sous l’automate). Remplir la bouteille de running buffer (bouteille avant à droite). Remplir la bouteille d’éthanol 70% (bouteille arrière à gauche) si nécessaire. Vider la poubelle (bouteille avant à gauche) dans le bidon à déchets liquides biologiques.
Mettre l’appareil sous tension (bouton on/off en bas à droite du panneau latéral). L’automate s'initialise, puis sur le menu principal : Appuyer sur l’onglet STATUS Si la colonne apparaît en rouge, l’appareil vous demande de changer la colonne. Basculer le cache transparent du portoir vers vous et ouvrir le panneau en face de vous en le tirant, ouverture vers la droite.
Si l’appareil n’est pas utilisé, il se peut qu’il y ait des colonnes d’attentes (vides), à ne pas jeter lors du changement de colonnes 
Sortir les colonnes usagées du bloc noir et deviser les extrémités. Les remplacer par des colonnes neuves, viser les extrémités sur les tubulures et replacer les colonnes sur le bloc (bien enfoncer les colonnes sur les guides du bloc).
Refermer le panneau et basculer le cache transparent du portoir à sa position initiale et confirmer sur l’écran que les colonnes sont changées, un cycle Rinse se lance pour hydrater les colonnes. Nb : 1 colonne sert pour 50 tris et doit être changée tous les 15 jours.

Puis, appuyer sur l’onglet SEPARATION

Sélectionner les positions du portoir en appuyant dessus sur l’écran (de 1 à 6 selon portoir utilisé)    Programmer le prog de séparation (menu déroulant) : Sélectionner en cliquant sur l’écran Posselwb (Positive Selection Whole Blood).
Selectionner le lavage onglet wash : Qrinse entre deux échantillons d’un même patient, Rinse entre deux tris d’échantillon de patient différent. 
Sortir le portoir réfrigéré du frigo (en bas à droite de l’automate).
Positionner le portoir sur son emplacement mettre les tubes à trier.  
Lancer le Run en appuyant sur RUN.
En fin de tri, sortir les tubes du portoir, et ranger ce dernier à +4°C.,
lancer un WASH NOW.
Appuyer sur SLEEP puis sur          à l’écran et enfin éteindre l’automate.