Protocole Purification de protéines avec un Tag GST.

Tampons :

Resuspension / binding buffer :                                              lysis buffer :                                      Cleavage buffer :

- 50 mM Tris pH7.5                                                         - 50 mM Tris pH7.5                         - 50 mM Tris pH7

- 500mM NaCl                                                                 - 500 mM NaCl                                 - 150 mM NaCl

- 1mM DTT                                                                        - 1% triton X100                               - 1mM DTT

                                                                                              - 1 mM DTT                                        - 1 mM EDTA

                                                                                              - 1 mM PMSF

                                                                                              - 5 mM Benzamidine

Production :

1.       Faire une préculture de 60ml ( compter 10ml de 2YT par erlen de 1L )

2.       Le lendemain, inoculer les cultures avec 10ml et faire pousser à 37°C jusqu’à DO 0.6

3.       Faire descendre la température des erlens à 16°C en les mettant dans la glace, environ 1h

4.       Induire avec de l’IPTG 0.5M, concentration finale 0.5mM IPTG

5.       Faire pousser O/N à 37°C:

6.       Centrifuger 1L de culture dans les grands pots à 5000g pendant 10min, en utilisant le rotor adapté.

7.       Resuspendre avec 100 ml de buffer resuspension

8.       Pooler la solution bactérienne concentrée dans un tube de 500 ml

9.       Centrifuger à 4°C 10 min à 5000g

10.   Eliminer le surnageant

11.   Congeler dans l’azote liquide

Purification :

1.       Incuber 5 ml de billes GSH sepharose pendant 20 min à 4°C avec 50 ml de lysis buffer

2.       Resuspendre le culot dans 100 ml de lysis buffer ( garder 2 µl pour un gel SDS, Extrait brute )

3.       Incuber avec un barreau aimanté pour homogénéiser la solution bactérienne concentrée.

4.       Soniquer 6 X 30 sec avec 30s – 1 min de pause entre chaque cycle ( maintenir la solution à froid )

5.       Clarifier le lysat en centrifugeant 30 min à 15000g ( rotor JA-17)

6.       Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, S = soluble

7.       Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, I = insoluble

8.       Répartir les billes incubées avec le tampon de lyse dans des tubes corning en fonction du volume de lysat clarifié.

9.       Incuber 2 h à 4°C sur une roue.

10.   Centrifuger le(s) tubes corning 10 min à 5000g 4°C

11.   Eliminer le surnageant ( garder 2 µl pour un gel SDS, NL = non lié avant coupure )

12.   Prendre 2 µl de billes pour un gel SDS, L = lié avant coupure

13.   Resuspendre les billes dans le tampon de binding en poolant dans 1 tube corning de 50 ml

14.   Laver 3 X avec du tampon de binding en centrifugeant 7min 5000g à 4°C

15.   Transférer les billes dans un tube de 15 ml

16.   Laver 3 X avec du tampon de clivage en centrifugeant 7min 5000g à 4°C

17.   Reprendre les billes dans 1V de billes avec le tampon de clivage

18.   Ajouter 160 µl de Precission

19.   Incuber O/N à 4°C sur une roue

20.   Centrifuger 10 min à 5000g 4°C

21.   Prendre 2 µl de billes pour un gel SDS, L = lié après coupure

22.   Prendre 2 µl de surnageant pour un gel SDS, NL = non lié après coupure = Protéine purifiée