Concentration ADN

L’ADN pour l’électroporation doit avoir une faible concentration en sel. L’ADN doit etre purifié par précipitation.
Purification d’ADN par précipitation :

1. Ajouter 5 à 10 µg de tRNA au 20µl de la reaction de ligation dans un tube de 1.5ml. Ajouter 22µl de 5M acétate ammonium ( ou un volume équal au volume de la réaction de ligation avec les tRNA. Bien mélanger.

2. Ajouter 100µl d’éthanol absolue ( ou 2.5 volumes de la reaction de ligation avec les tRNA . Glace 15 min.

3. Centrifuger >12,000 x g pour 15 min à 4°C. Eliminer le surnageant.

4. Laver le culot avec 1 ml de 70% ethanol. Centrifuger >12,000 x g pendant 15 min à RT. Eliminer le surnageant.

5. Sécher le culot.

6. Resuspendre avec du tampon EB. Pour les réactions de ligation, il faut reprendre dans 10µl


DEUXIÈME MÉTHODE de qiagen :

Ethanol Precipitation of DNA
Reagents Needed:

• 3 M sodium acetate pH 5.2 or 5 M ammonium acetate
• DNA
• 100% ethanol

Protocol

1. Measure the volume of the DNA sample.
2. Add 1/10 volume of sodium acetate, pH 5.2, (final concentration of 0.3 M)
- These amounts assume that the DNA is in TE only; if DNA is in a
solution containing salt, adjust salt accordingly to achieve
the correct final concentration.
3. Mix well.
4. Add 2 to 2.5 volumes of cold 100% ethanol (calculated after salt addition).
5. Mix well.
6. Place on ice or at -20 degrees C for >20 minutes.
7. Spin a maximum speed in a microfuge 10-15 min.
8. Carefully decant supernatant.
9. Add 1 ml 70% ethanol. Mix. Spin briefly. Carefully decant supernatant.
10. Air dry or briefly vacuum dry pellet.
11. Resuspend pellet in the appropriate volume of TE or water.

autre protocol voir ici

TROISIEME METHODE avec glycogen

Procedure   
- Add 0.1 volumes of 3M Sodium Acetate solution to 1 volume of DNA sample.  
- Add 1ul Glycogen to the DNA sample.  
- Add 2 volumes of 95% EtOH to the DNA Sample.  
- Store the solution overnight at -20°C or for 30 minutes at -80°C.  
- Centrifuge the solution at maximum speed for least 15 minutes.  
- Decant and discard the supernatant.  
- (Optional) Add 1 ml of 70% EtOH to the pellet and let sit for 5 minutes.  
- (Optional) Centrifuge the sample at maximum spped for 5 minutes.  
- (Optional) Decant and Discard the supernatant.  
- Air-dry the pellet for 10-15 minutes at room temperature until all liquid is gone.  
-Resuspend in desired volume of water or buffer

Article sur l'effet de la durée d'incubation, la température et le temps de centrifugation lors de la précipitation d'ADN

Protocole de clonage : Préparation du vecteur

Préparation d'un vecteur en vue du clonage :
- Transformation du vecteur dans des bactéries Xl1Blue
- Préparer 4 pré cultures de 10ml en milieu 2YT sélectif
- Miniprep sur les pré cultures (midiprep de préférence et éluer dans 100µl d'H2O)
- Eluer dans 4 X 50µl d'eau stérile pH 7.5
- Mesurer la concentration
- Digestion du vecteur, il faut essayer d'avoir 5µg de vecteur, rajouter les enzymes 1µl, le tampon 10X, la BSA 100X, avec un qsp à 50µl ou 100µl dépend du volume de vecteur a rajouter.
- Digestion O/N à 37°C de 18h à 9h

Réaction de déphosphorylation
- ne pas ajouter 10µl de Tp 10X SAP au 100µl ou 50µl de vecteur purifié
- 2µl de phosphatase de crevette
- 2h à 37°C
- inactivation de l'enzyme SAP 15min à 65°C

- Déposer la totalité du produit de digestion déphosphorylé sur gel d'agarose 1%, 100µl + 10µl de loading buffer
- Découpage des bandes correspondant au vecteur, pour éliminer l'insert, attention à bien nettoyer la lame avec de l'éthanol 70%, si on veut purifier plusieurs vecteurs différents, afin d'éviter les contaminations croisées
- Utillisation du kit Qiagen Gel Extraction
- Elution dans 30µl d'eau stérile