vendredi 12 décembre 2008
vendredi 5 décembre 2008
vendredi 28 novembre 2008
Extraction d'ADN de S.cerevisiae (levure)
Utilisation du kit "wizard genomics DNA purification kit" de promega
Le moins evident de pouvoir apprecier l'effet de la lyticase
1- Préculture O/N de S228g dans 5ml de milieu YPD à 30°C et 200rpm
2- Culture de 10ml en milieu YPD pendant 20h à 30°C
3- Centrifuger 2min à 13000g à8°C
5- Addition de 100µl de lyticase 20mg/ml (moi dans mon cas j'ai commander cette lyticase chez sigma refL2524-25KU)
6- Incubation à 37°C pendant 2h
7-Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
8- Resuspendre dans 3ml de Nuclei Lysis Solution
9- Ajouter 1ml de proteine precipitation solution, vortexer et incuber 5min dans la glace
10- Centrifugation à 13000g pendant 3min à8°C
11- Transferer le surnageant dans un tube propre et ajouter 3ml d'isopropanol (mis à RT avant) et mélanger par retournemant de tube.
12- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
13- Vider le surnageant et laver avec 3ml d'éthanol 70% (mis à RT avant)
14- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
15- Vider le maximun d'éthanol par pipettage et laisser évaporer le reste
16- Rehydrater dans 500µl de DNA rehydration solution
17- Ajouter 15µl de Rnase et incuber 15min à 37°C
18- Laisser finir la rehydratation en placant le tube O/N à 4°C ( ou 1h à 65°C)
Modifications :
- à 20 on suit le protocole en adaptant les volumes ( données pour 1ml de culture dans le protocole Promega), au final on remet l'ADN en solution en tampon TE10.1)
A la fin de 10ml de culture on récupère 500µl de solution d'ADN à environ 100ng/µl, ce qui permet de faire environ 500PCR.
Le moins evident de pouvoir apprecier l'effet de la lyticase
1- Préculture O/N de S228g dans 5ml de milieu YPD à 30°C et 200rpm
2- Culture de 10ml en milieu YPD pendant 20h à 30°C
3- Centrifuger 2min à 13000g à8°C
5- Addition de 100µl de lyticase 20mg/ml (moi dans mon cas j'ai commander cette lyticase chez sigma refL2524-25KU)
6- Incubation à 37°C pendant 2h
7-Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
8- Resuspendre dans 3ml de Nuclei Lysis Solution
9- Ajouter 1ml de proteine precipitation solution, vortexer et incuber 5min dans la glace
10- Centrifugation à 13000g pendant 3min à8°C
11- Transferer le surnageant dans un tube propre et ajouter 3ml d'isopropanol (mis à RT avant) et mélanger par retournemant de tube.
12- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
13- Vider le surnageant et laver avec 3ml d'éthanol 70% (mis à RT avant)
14- Centrifugation à 13000g pendant 2min à8°C
15- Vider le maximun d'éthanol par pipettage et laisser évaporer le reste
16- Rehydrater dans 500µl de DNA rehydration solution
17- Ajouter 15µl de Rnase et incuber 15min à 37°C
18- Laisser finir la rehydratation en placant le tube O/N à 4°C ( ou 1h à 65°C)
Modifications :
- à 20 on suit le protocole en adaptant les volumes ( données pour 1ml de culture dans le protocole Promega), au final on remet l'ADN en solution en tampon TE10.1)
A la fin de 10ml de culture on récupère 500µl de solution d'ADN à environ 100ng/µl, ce qui permet de faire environ 500PCR.
mercredi 29 octobre 2008
vendredi 24 octobre 2008
mercredi 17 septembre 2008
Manuel d'utilisation de la Taq DNA polymérase
Manuel d'utilisation de la Taq DNA polymérase ici, ou aller voir sur le site de invitrogen
Manuel d'utilisation de la Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity
Manuel d'utilisation de la Platinum® Taq DNA Polymerase High Fidelity ici ou aller voir sur le site de invitrogen
Elongation à 68°C, 1 min / KB
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