Réaction controle de la réaction de ligation T4 DNA ligase

Procédure tri plasmocytes sur robot MACS miltenyi biotec

Avant chaque tri Préparer 2 bouteilles de 1litre de Running buffer stérile. PBS 1X pH 7.2 0,5 % BSA 2 mM EDTA stocker à + 4°C.

Préparer 1 litre d’ethanol 70% stérile.

Marquage plasmocytes :  vérifier la présence de plasmocytes CD19low CD27bright /CD19 au FACS. Si plasmocytes >5% procéder au tri.

Mesurer le volume final de sang total (réception des échantillons sur tube ACD-A)

Ajouter 50µl de Whole Blood CD138 MicroBeads (ref 130-093-062) par ml de sang total.
Homogéneiser par retournement et incuber 15 min a +4°C Laver avec 2 à 5 ml de Running buffer par ml de sang total ( aliquoter en conséquence). Puis centrifuger 10 min à 445g (environ 1500t) sans le FREIN Aspirer le surnageant en laissant 2 mm de buffer et sans aspirer de cellule en surface. Resuspendre de culot en ajoutant un volume de buffer pour un volume du culot  (ex si culot de 5 ml ajouter 5 ml de buffer) Attention : ne pas dépasser un volume final de 13ml car le robot procède a une dilution 1/3 dans l’automate qui stoppe le tri s’il ne peut faire cette dilution.

Procéder au tri sur automate. Matériel nécessaire : Running buffer   environ   2 litres / 50ml de sang total à trier
Ethanol 70%  Tubes de 50 ml pour recueillir la fraction négative et tube de 15ml pour recueillir les plasmocytes triés. Colonnes de tri  Gants.

En arrivant au robot, il faut vérifier que les bouteilles soient pleines et la poubelle du robot soit vide. Sinon : Remplir la bouteille de Wash solution (bouteille arrière à droite) si nécessaire. La Wash solution est déjà sur site (sous l’automate). Remplir la bouteille de running buffer (bouteille avant à droite). Remplir la bouteille d’éthanol 70% (bouteille arrière à gauche) si nécessaire. Vider la poubelle (bouteille avant à gauche) dans le bidon à déchets liquides biologiques.
Mettre l’appareil sous tension (bouton on/off en bas à droite du panneau latéral). L’automate s'initialise, puis sur le menu principal : Appuyer sur l’onglet STATUS Si la colonne apparaît en rouge, l’appareil vous demande de changer la colonne. Basculer le cache transparent du portoir vers vous et ouvrir le panneau en face de vous en le tirant, ouverture vers la droite.
Si l’appareil n’est pas utilisé, il se peut qu’il y ait des colonnes d’attentes (vides), à ne pas jeter lors du changement de colonnes 
Sortir les colonnes usagées du bloc noir et deviser les extrémités. Les remplacer par des colonnes neuves, viser les extrémités sur les tubulures et replacer les colonnes sur le bloc (bien enfoncer les colonnes sur les guides du bloc).
Refermer le panneau et basculer le cache transparent du portoir à sa position initiale et confirmer sur l’écran que les colonnes sont changées, un cycle Rinse se lance pour hydrater les colonnes. Nb : 1 colonne sert pour 50 tris et doit être changée tous les 15 jours.

Puis, appuyer sur l’onglet SEPARATION

Sélectionner les positions du portoir en appuyant dessus sur l’écran (de 1 à 6 selon portoir utilisé)    Programmer le prog de séparation (menu déroulant) : Sélectionner en cliquant sur l’écran Posselwb (Positive Selection Whole Blood).
Selectionner le lavage onglet wash : Qrinse entre deux échantillons d’un même patient, Rinse entre deux tris d’échantillon de patient différent. 
Sortir le portoir réfrigéré du frigo (en bas à droite de l’automate).
Positionner le portoir sur son emplacement mettre les tubes à trier.  
Lancer le Run en appuyant sur RUN.
En fin de tri, sortir les tubes du portoir, et ranger ce dernier à +4°C.,
lancer un WASH NOW.
Appuyer sur SLEEP puis sur          à l’écran et enfin éteindre l’automate.