Marquage des plasmocytes sur sang total

On utilise les anticorps suivant :
- CD27 PE ==> cellule memoire plasmocytaire
- CD19 APC ==> total des cellules B
- CD138 Per Cy5.5 ==> plasmocytes

combinaison des 3 ==> populations plasmocytaires

dans un tube à hémolyse on met :
- 10µl de CD138
- 10 µl de CD27
- 5 µl de CD19

dans la boite plasmo lyB
-  on met 200 µl de sang total dans le tube à hémolyse
- vortex
- 15 min dans le noir
- 4 ml de tp de lyse ( 10X au départ on l'utilise 1X) qui contient un agent de lyse et du paraformaldéhyde pour fixer les plasmocytes, on lyse les globules rouges car sinon au facs, on aurait un bruit de fond très important, car les globules rouges sont de grosses structures biconcaves et le rayon se dévier fréquemment.
- centrifugation 5 min 1500g, dans le culot on va avoir les lymphocytes et les granuleux.
- on jete le surnageant (élimination des globules rouges)
- lavage 2 ml de PBS BSA
- centrifugation 5 min 1500g
- élimination du surnageant
- on reprend dans 200µl de PBS BSA
- on passe au FACS, les plasmocytes sont CD19low CD27bright /CD19 au FACS, si population de plasmocytes en dessous de 5 % , abondonner

Ligation control

Controls should be run to test the cells and DNA when using T4 DNA Ligase?

1. Transforming uncut vector in the competent cells checks cell viability and tests the antibiotic resistance of the plasmid. Plate on media and media plus antibiotic.
2. Linearized vector tests for background due to uncleaved plasmid. Should be <1 1.="1.">
3. Cut and religated plasmid tests ligase activity and DNA end integrity. Should be near the value obtained in 1.
4. Cut, phosphatased, religated plasmid tests background due to incomplete phosphatase treatment. Should be <1>