RT PCR avec SuperScript 3

Introduction : 

Description SuperScript™ ID Reverse Transcriptase is an engineered version of M-MLV RT with reduced RNase H activity and mcreased thermal stability.

The enzyme is purified to near homogeneity from E. coli containing the modified pol gene of Moloney Murine Leukemia Virus (1,2). The enzyme can be used to synthesize first-strand cDNA at temperatures up to 55°C, providing increased specificity, higher yields of cDNA, and more full length product than other reverse transcriptases. It can generate cDNA from 100 bp to >12 kb.

First-Strand cDNA Synthesis :

The following 20 µl reaction volume can be used for 10 pg-5 pg of total RNA or 10pg-500ng of mRNA.

1. Add the following components to a nuclease-free microcentrifuge tube :
- l µl of oligo(dT)20 (50 pM); or 200-500 ng of oligo(dT)12-18, or 50-250 ng of random primers; or 2 pmol of gene-specific primer.
- 10 pg-5 µg total RNA or 10 pg-500 ng mRNA
- l µl 10 mM dNTP Mix (10 mM each dATP, dGTP, dCTP and dTTP at neutral pH)
Stérile, distilled water to 13 µl

2. Heat mixture to 65°C for 5 minutes and incubate on ice for at least 1 minute

3. Collect the contents of the tube by brief centrifugation and add:
- 4 µL 5X First-Strand Buffer
- l µl 0.1 M DTT
- l µl RNaseOUT (Recombinant RNase Inhibitor. Note: When using less than 50 ng of starting RNA, the addition of RNaseOuT is essential.
- l µL of SuperScript 3 RT (200 units/µl) *If generating cDNA longer than 5 kb at temperatures above 50°C using a gene-specific primer or oligo(dT)20, the amount of SuperScript may be raised to 400 U (2 µl) to increase yield.

4. Mix by pipetting gently up and down. If using random primers, incubate tube at 25°C for 5 minutes.

5. Incubate at 50°C for 30-60 minutes. Increase the reaction temperature to 55°C for gene-spedfic primer. Reaction temperature may also be increased to 55°C for difficult templates or templates with high secondary structure.

6. Inactivate the reaction by heating at 70°C for 15 minutes.

The cDNA can now be used as a template for amplification in PCR. However, amplification of some PCR targets (those >1 kb) may require the removal of RNA complementary to the cDNA. To remove RNA complementary to the cDNA, add l µl (2 units) of E.coli RNase H and incubate at 37°C for 20 minutes.

Protocole ILLUMINA TRANSCRIPTOME

(12-Samples)

(Hybridation des lames, lavage/blocage/détection/lavage/centrifugation et lecture)

JOUR  1 (hybridation / incubation / préparation du tampon High Temp Buffer)
Temps de manipe : environ 20 minutes (démarrer vers l 6h)
Temps d'incubation : 16-20 heures

 MATERIEL
 HYB 10µl/échantillon (-20°C)
1 pipette multicanal 0.1-10^1
1 rack stérile
HCB 400µl/lame (-20°C)
 10X High-Temp Wash buffer 50ml (Température ambiante)
1 Eprouvette de 500ml en verre
RNase free water 500ml
Parafilm
1 feutre!!! Les lames!!!

- Préparer les ARNa : déposer dans la glace 750ng d'ARNa qsp 5µl d'eau RNase-free. Utiliser des barrettes RNase free 0.2µl de 8 échantillons, à bouchon unique, 1 barrette pour une lame.

- Descendre sur la plateforme ilIumina.
- Préchauffer le four à hybridation à 58°C.
 - Déposer les Tubes HYB et HCB dans le four à 58°C durant 10 minutes pour dissoudre les sels précipités. (Si au bout de 10 minutes il reste des sels, remettre les tubes dans le four durant 10 autres minutes). Mélanger les tubes avant utilisation. '

- Ajouter 10µl de HYB à chaque ARNa avec la pipette multicanal après avoir déposé 500µl de HYB (pour 4 lames) dans un rack stérile à usage unique.
- Mélanger et centrifuger brièvement les échantillons.
- Fragmenter les échantillons 5 minutes à 65°C (thermocycleur BioRad, Cliquer sur RUN puis sélectionner le programme GEX65).
- Centrifuger brièvement les échantillons.

- Préparer la chambre à hybridation (Hyb chamber + Hyb Chamber gasket).
 - Déposer 200µl de HCB dans les réservoirs de la chambre à hybridation.
- Pour éviter l’évaporation du tampon HCB, fermer la chambre d'hybridation avec son couvercle le temps de procéder à hybridation.

 - Retirer les lames de leurs emballages (manipuler les lames du coté du code barre, avec des gants sans poudre ou à la pince).
 - Déposer les lames dans les Hyb Chamber Inserts dans le sens du code barre.
- Déposer les  15µl de l'échantillon. (Noter l'ordre des positions des 8 échantillons).
- Placer les lames + Hyb Chamber Inserts dans la Chambre à Hybridation.
- Fermer le couvercle de la chambre à hybridation (Attention de bien appuyer sur le couvercle en fermant les charnières)
-Incuber 16-20 h à 58°C dans le four à hybridation sous agitation (position 5).
- Préparer le 1X High-Temp Wash buffer en ajoutant 50ml du stock 10X dans 450 ml de RNase Free water)
- Placer le tampon dans le bloc chauffant à 55°C, fermer le bloc chauffant et laisser incuber toute la nuit.

JOUR 2 (lavage/blocage, détection/lavage/centrifugation)
Temps de manipe : environ 65 minutes (démarrer vers 10h)

MATERIEL
10X High-Temp Wash buffer 500ml (55°C, préparé la veille et incubé toute la nuit)
Block E1 buffer 6ml/lame (4°C)
 1 Falcon de 15ml
Wash E1BC 2L (Température ambiante)
 1 Bouteille de 2L
RNase free water 2 L
Strepatvidin-Cy3 2µl à 1 mg/ml par puce (-20°C)
Ethanol 100% 250ml (Température ambiante)
Pipette Boy!!
1 Feutre !!!

- Allumer le scanner en arrivant.

- Ajouter 6ml de E1BC buffer (=WBC) dans 2L d'eau RNase-free.

- Déposer dans le tube Falcon 2ml de Block E1buffer + 2µl de streptavidin-Cy3 à 1mg/ml (Si plusieurs lames, préparer dans le même tube). Placer le tube dans le noir jusqu'à utilisation.

- Mettre environ 750ml d’E1BC buffer dilué dans le cristallisoir.
- Retirer la chambre d'hybridation du four.
- Prendre la 1ere lame et la placer dans les 750ml de E1BC buffer dilué.
- Retirer le film de la lame en restant immergé.
- Placer la lame dans le portoir à lame (spotting vers l’extérieur) immergé dans 250ml d’E1BC buffer dilué.
- Procéder de la même façon pour toutes les lames.

- Plonger ensuite le portoir dans le block chauffant contenant le High-Temp buffer à 55°C, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 10 minutes avec le couvercle fermé.

- Durant l'incubation mettre 250 ml d’E1BC buffer dilué dans un plat transparent propre.
- Après les 10 minutes d'incubation, transférer immédiatement le portoir à lame dans les 250ml d’E1BC buffer dilué. Faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber  5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).
- Transférer le portoir à lame dans un plat transparent contenant 250ml d'E1BC, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 2 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer les lames dans les portoirs en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 4ml de E1 Block buffer et les déposer sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Placer les lames dans un nouveau portoir en plastique blanc (Spotting vers le haut).
- Pipeter 2ml de E1 Block buffer + Strepatvidin-cy3 et déposer les sur la lame.
- Incuber  10 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Déposer 250ml de E1BC buffer dilué dans un plat propre.
- Déposer les lames dans le portoir à lame et immerger le portoir dans le tampon E1BC buffer dilué, faire 5 mouvements de haut en bas avec le portoir à lame puis incuber 5 minutes sous agitation (Rocker à la vitesse maximal).

- Préparer la centrifugeuse : mettre du papier absorbant sur les plots qui vont être utilisés pour centrifuger les lames
- Déposer rapidement les lames dans deux portoirs à lame propres et centrifuger à 275g durant 4 minutes à 25°C.
- Scanner les lames

SCAN
- Allumer le scan au moins 30 min avant de scanner les lames.
- Mettre le CD correspondant à la lame dans l'ordinateur.
- Copier le dossier decode data de chaque CD dans my document/P3S’s Document/illumina/TiphaineTranscriptome/decode data.
- Dans le dossier TiphaineTranscriptome/sample sheet, créer une feuille de route Excel en.csv avec la position des échantillons sur la lame, le numéro de la lame, la date du scan...
- Ouvrir BeadStudio et vérifier sur la page d'accueil du site Illumina qu'il n'y a pas une nouvelle version du manifest de la lame HumanRef-8v2.
- Lancer le logiciel BeadScan.