Généralités sur le Nanodrop et le bioanalyseur

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Protocole Amplification Ambion illumina

Quantité d’ARNt recommandé pour l’amplification (50-500 ng) le mieux c’est 200 ng

1. Synthèse du premier brin d’ADNc :

Dans la glace

Déposer un volume maximal de 5,5µl d’ARN totaux dans un microtube 0,2ml stérile Rnase-Free.
Ajouter de l’eau nucléase free pour compléter à 5,5µl si nécessaire.

Décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légèrement si nécessaire.

A température ambiante assembler dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 oligo (dT) Primer	0.5	3.2
10X First Strand Buffer	1	6.3
dNTP Mix	2	12.6
Rnase Inhibitor	0.5	3.2
ArrayScript	0.5	3.2
Total (µl)	4.5	28.5

Use 4,5µl of Reverse Transcription Master Mix per reaction.

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 4,5µl de Mix dans chaque tube (Vf=10µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h à 42°C (thermocycleur + couvercle chauffant non fermé)
⇒ Glace

2. Synthèse du second brin d’ADNc :

10 minutes avant la fin du programme PCR (2h à 42°C), décongeler les réactifs dans la glace. Vortexer et centrifuger doucement les tampons. Mélanger les tubes d’enzyme en tapotant doucement le fond du tube avec le doigt et vortexer légerement si nécessaire.

Dans la glace ajouter dans l’ordre dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
Nuclease Free Water	31.5	198.5
10X Second Strand Buffer	5	31.5
dNTP Mix	2	12.6
DNA Polymérase	1	6.3
Rnase H	0.5	3.2
Total (µl)	40	252.1

Use 40µl of second Strand Master Mix per reaction

Mélanger le MIX en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 40µl de Mix dans chaque tube (Vf = 50µl).
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brievement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube.

⇒ 2h 16°C (thermocycleur sans couvercle chauffant).
⇒ Glace (l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

3. Purification de l’ADNc :

Apres purification, on peut mettre à -20°C
Speed Vacquer les échantillons 1h15 min pour les sécher complètement.

Une fois speed vacquer :
- Ajouter 8,75 µl d’eau Nucléase Free à 50°C au culot SpeedVacqué ( l’échantillon peut etre gardé à -20°C)

4. Transcription in vitro :

A tempétature ambiante ajouter dans l’ordre suivant dans un tube 1,5ml Eppendorf Rnase-Free :

Component	per rxn	réactifs /2 reagent amounts (µl) with 5% Extra (MIX x6)
T7 10X Reaction Buffer	1.25	8
T7 Enzyme Mix	1.25	8
Biotin-16-UTP	1.25	8
Total (µl)	40	24

Use 3,75 µl of IVT Master Mix per reaction

Mélanger le Mix en vortexant doucement.
Centrifuger brievement pour collecter le Mix dans le fond du tube et placer dans la glace.

Transférer 3,75µl de Mix dans chaque tube (Vf = 12,5µl)
Mélanger en pipetant plusieurs fois et centrifuger brièvement si nécessaire pour récolter la réaction dans le fond du tube

⇒ 4H - 14h à 37°C
⇒ Stopper la réaction avec 87,5µl d’eau nucléase free. (Vf=100µl)

5. Purification des ARNa :

⇒ Nanodrop